miR-638通过SPAG1介导调控猪睾丸支持细胞生长的研究

摘要

microRNA(miRNA)能与特定基因结合，直接降解靶基因的mRNA或者抑制靶基因的翻译过程，在动植物体内发挥重要的调控作用。大量的研究表明，在动物睾丸组织中miRNA对睾丸的发育和成熟及精子发生过程发挥至关重要的作用。我们课题组前期经过测序分析已经证实miR-638在大白猪性成熟前后睾丸组织中差异表达;miR-638能够靶向精子相关抗原1（Sperm-associated antigen1，SPAG1）基因，并对公猪睾丸支持细胞的凋亡有一定的影响。在这些基础上，本课题以miR-638为主要研究对象，探究miR-638对猪睾丸ST细胞生长的影响以及在猪精子发生过程中的作用，并探究相关分子调控机制。本课题主要研究结果如下:
　　1.miR-638和靶基因SPAG1对ST细胞功能的影响
　　通过合成miR-638mimic和inhibitor分别来超表达miR-638和抑制表达miR-638。通过构建靶基因SPAG1的干扰片段SPAG1-siRNA来抑制表达SPAG1基因。
　　通过流式细胞仪检测miR-638对ST细胞周期的影响，实验结果表明:超表达miR-638可以抑制ST细胞周期S期的比例，抑制ST细胞由G1期向S期的转化;抑制表达SPAG1基因同样也可抑制ST细胞周期S期的比例，抑制G1期向S期的转化。实验结果表明，miR-638和靶基因SPAG1对ST细胞的作用效果相似，说明miR-638通过靶基因SPAG1对ST细胞的细胞周期产生影响。通过MTT法检测了miR-638对ST细胞增殖的影响，实验结果表明:超表达miR-638可以显著抑制ST细胞增殖，抑制表达miR-638可以显著促进ST细胞的增殖。
　　2.miR-638调控ST细胞生长的分子机制研究
　　通过Q-PCR和Western blot实验检测miR-638对细胞周期调控相关基因的影响，实验结果表明:超表达miR-638能抑制ST细胞中c-MYC、CCNE1、CCND1和CDK4的表达水平;同样，抑制表达SPAG1抑制c-MYC、CCNE1、CCND1和CDK4的表达水平。
　　通过Western blot检测miR-638和靶基因SPA G1对PI3K/AKT通路的作用，实验结果表明:超表达miR-638能够抑制ST细胞中PI3K和AKT蛋白质磷酸化水平，抑制表达miR-638能够促进PI3K和AKT蛋白质磷酸化水平;同样，抑制表达SPAG1可以抑制ST细胞中PI3K和AKT蛋白质磷酸化水平。
　　3.SPAG1对细胞有丝分裂的影响
　　通过免疫荧光实验检测了SPAG1蛋白在ST细胞核中的定位，实验结果表明:在细胞有丝分裂中期和末期，SPAG1蛋白与微管蛋白α-tubulin共定位，表明SPAG1可能通过调控纺锤体的组装来调控细胞有丝分裂过程，从而调控ST细胞的生长。

目录

论文说明

声明

摘要

中英文缩写对照表

1 研究问题的由来

2 精子发生

2．1 精子发生过程

2．2 睾丸支持细胞在精子发生过程中的作用

3 精子发生相关microRNA的研究进展

4 miR-638的研究进展

5 SPAG1基因的研究进展

6 磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)与细胞生长

6．2 PI3K与细胞周期

7 miRNA与细胞有丝分裂

8 研究的目的与意义

1．1 实验材料

1．2 主要仪器设备

1．3 主要试剂与试剂盒

1．4 常用试剂及配制

2 实验方法

2．2 细胞的培养

2．3 实时定量验证

2．4 Western Blot验证

2．5 MTT检测细胞增殖

2．6 流式细胞仪检测细胞周期

2．7 流式细胞仪检测细胞凋亡

1 结果与分析

1．1 miR-638对ST细胞的影响

1．2 SPAG1对ST细胞生长的影响

1．3 c-MYC对ST细胞生长的影响

1．4 miR-638对PI3K／AKT信号通路的影响

1．6 SPAG1对细胞有丝分裂的影响

第四章 讨论

2 miR-638与细胞凋亡

3 miR-638与有丝分裂

4 miR-638与精子发生

1 主要结论

2 下一步工作

参考文献

致谢