甘蓝型油菜种皮颜色基因的精细定位与种皮转录组分析

摘要

甘蓝型油菜是世界上重要的油料作物之一，是我国最主要的食用植物油来源。在相同遗传背景下，与黑籽油菜相比，黄籽油菜的种子具有多方面的优势:种皮薄、含油量和蛋白质含量高、纤维素和多酚物质含量低、色素少、油质清澈透明等，因此选育高产优质的甘蓝型黄籽油菜是油菜育种中改良甘蓝型油菜品质的一条重要途径，油菜的黄籽性状也成为了油菜品质育种的研究热点。本研究以来源于甘蓝型黑籽油菜94570和人工合成甘蓝型黄籽油菜No.2127-17的褐籽和黄籽近等基因系为材料，对其种皮颜色基因D进行精细定位，并对褐籽和黄籽不同发育时期种皮的类黄酮含量和转录组进行比较分析，为进一步克隆油菜种皮颜色基因和阐述油菜黄籽形成的分子机制奠定了基础。本研究主要结果如下:
　　1.甘蓝型油菜种皮颜色基因D的定位
　　通过AFLP技术和白菜、甘蓝型油菜参考基因组序列信息开发标记，获得了一系列IP、SSR和SNP标记，将种皮颜色基因D定位在甘蓝型油菜A9连锁群上SSR标记H2SSR120和H2SSR237之间1.53cM的区间内，对应甘蓝型油菜‘Darmor-bzh’参考基因组A9染色体上约140kb的范围。
　　通过全基因组重测序结合混合分组分析(BSA)的方法，获得1个种皮颜色基因D的候选区段，位于甘蓝型油菜A9染色体上27.65Mb-32.73Mb，与遗传连锁分析分析结果一致。通过开发Indel标记，获得19个多态性标记，覆盖约830kb大小的区段，进一步加密遗传连锁图，将目标基因定位在InDel标记BnA9ID60-3和BnA9ID161-1之间，2个标记在甘蓝型油菜A9染色体的距离约为105kb。
　　2.甘蓝型黄籽和褐籽油菜种皮中原花青素含量存在显著差异
　　对亲本和近等基因系发育过程中的种子及其胚、种皮进行原花青素及其前体物质黄烷醇的化学染色，结果表明甘蓝型油菜种子的原花青素主要在内种皮中积累，而且从开花后21天开始直至种子成熟时期，黄籽油菜的种皮中原花青素及其前体物质的含量都显著低于黑/褐籽。LC-ESI-MS/MS分析结果表明原花色素合成途径中一些关键的可溶性代谢物在黄籽种皮中的相对含量从开花后21天之后低于黑/褐籽。不溶性原花青素含量的比较分析也表明黄籽种皮不溶性原花青素含量远远低于黑/褐籽种皮。
　　3.甘蓝型黄籽和褐籽油菜不同发育时期种皮的转录组比较分析
　　通过对褐籽、黄籽近等基因系中5个不同发育时期种皮的转录组进行比较分析，发现了褐籽和黄籽之间在种皮的5个发育时期总共有4，974个差异表达基因，其中3，128个在黄籽种皮中上调表达，1，835个在黄籽种皮中下调表达。GO功能富集分析发现上调基因主要富集在各种与刺激响应相关的生物过程中，而下调基因主要富集在次生代谢过程，尤其是是苯丙烷和类黄酮代谢过程。KEGG富集分析结果表明181个上调表达基因显著富集在7个通路上，主要包括植物-病原菌互作、植物激素信号转导和内质网上的蛋白加工、脂肪酸延长等通路，这些通路主要与植物刺激响应相关。而下调基因显著富集在次生代谢物合成、苯丙烷合成、类黄酮合成、苯丙氨酸代谢等通路上。
　　4.甘蓝型油菜种皮中类黄酮合成相关基因的表达差异是黄籽和褐籽种皮颜色差异的根本原因
　　参与类黄酮合成途径的12个关键结构基因(PAL、C4H、4CL3、CHS、CHI、F3H、DFR、ANS、ANR、TT12、AHA10、TT19)和3个转录因子基因（TT1、TT8、TT16)在黄籽种皮中均下调表达，使黄籽种皮中原花青素合成受阻，是黄籽和褐籽种皮颜色的差异形成的主要原因。这些与原花青素合成相关的基因在甘蓝型油菜种皮发育过程中表现了相似的表达模式，表明这些基因可能共同受一个上游的调控因子调控。通过差异表达的转录因子基因的表达模式分析，鉴定出3个新的可能参与类黄酮合成的调控网络的转录因子基因，包括2个MYB-related基因(BnaA09g44970D、BnaA09g44370D)和1个bHLH基因(BnaA09g42390D)。
　　5.种皮颜色基因D定位区间的候选基因的筛选
　　通过共线性分析将种皮颜色基因D的定位区间锁定在甘蓝型油菜A9染色体105kb的区段和chrA09random339kb的区段上或者白菜基因组A9染色体的545kb的区段内。通过与拟南芥基因组进行BLASTP比对，进行基因注释，发现该区段内存在130个基因。结合黄籽、褐籽种皮转录组比较分析结果，在基因D的定位区段筛选出36个注释基因作为候选基因，其中包含一些可能参与类黄酮合成的转录因子基因和编码与转运相关的蛋白的基因。

目录

声明

摘要

缩略语表

1 文献综述

1．1 黄籽油菜的性状特点

1．2 油菜种皮颜色的遗传研究

1．3 油菜种皮颜色基因的定位和克隆

1．3．1 白菜型油菜种皮颜色基因的定位和克隆

1．3．2 芥菜型油菜种皮颜色基因的定位和克隆

1．3．3 埃塞俄比亚芥种皮颜色基因的定位

1．3．4 甘蓝型油菜种皮颜色基因的定位

1．3．5 油菜类黄酮途径基因的同源克隆

1．4 油菜黄籽性状的形成机制

1．4．1 拟南芥和甘蓝型油菜种皮结构

1．4．2 拟南芥种皮颜色形成机制

1．4．3 甘蓝型油菜种皮颜色形成机制的初步探讨

1．5 芸薹属植物基因定位的策略

1．5．1 图位克隆

1．5．2 重测序分析

1．5．3 转录组测序分析

1．6 本研究的目的和意义

2 材料和方法

2．1 试验材料

2．2 种子含油量的测定

2．2．1 NIRS法测定甘蓝型油菜种子品质

2．2．2 气相色谱内标法检测种子脂肪酸含量

2．3 分子标记分析

2．3．1 油菜DNA的提取

2．3．2 AFLP标记分析

2．3．3 SSR标记的开发

2．3．4 IP标记的开发

2．3．5 基于SNP芯片的SNP引物开发

2．3．6 全基因组重测序分析

2．3．7 连锁图谱构建

2．4 种皮类黄酮含量的检测

2．4．1 原花青素的香草醛和DMACA检测

2．4．2 种皮中代谢物的粗提取及LC-MS／MS分析

2．4．3 不溶性原花青素含量的检测

2．5 种皮转录组分析

2．5．1 RNA的提取、cDNA文库的构建和测序

2．5．2 RNA-seq数据的处理

2．5．3 qRT-PCR验证

3 结果与分析

3．1 甘蓝型黄籽、黑／褐籽油菜成熟种子的品质特征

3．2 种皮颜色基因D的定位

3．2．1 基于白菜基因组信息开发SSR、IP、SNP标记

3．2．2 基于AFLP标记和甘蓝型油菜基因组信息开发SSR标记

3．2．3 基于重测序数据开发标记

3．2．4 种皮颜色基因D的遗传定位与定位区段的共线性分析

3．3 甘蓝型黄籽、黑／褐籽油菜种子发育过程中种皮的类黄酮含量比较分析

3．3．1 甘蓝型黄籽、黑／褐籽油菜种皮的化学染色

3．3．2 甘蓝型黄籽、黑／褐籽油菜种皮可溶性类黄酮含量的比较

3．3．3 甘蓝型黄籽、黑／褐籽油菜不溶性原花青素含量的比较

3．4 甘蓝型黄籽、褐籽油菜近等基因系种皮的转录组比较分析

3．4．1 RNA-seq数据分析

3．4．2 甘蓝型黄籽、褐籽油菜近等基因系种皮差异表达基因的筛选

3．4．3 黄籽、褐籽种皮差异表达基因的GO和KEGG富集分析

3．4．4 黄籽、褐籽种皮中类黄酮合成相关基因的表达水平比较分析

3．4．5 差异表达的转录因子基因的筛选

3．4．6 qRT-PCR验证

3．5 种皮颜色基因D定位区间的候选基因的筛选

4 讨论

4．1 比较基因组与基于WGR的BSA在油菜基因定位中的应用

4．2 甘蓝型油菜种皮颜色基因定位的复杂性

4．3 原花青素的合成和积累是甘蓝型黄籽、褐籽油菜种皮颜色差异的主要原因

4．4 参与类黄酮合成的新转录因子

4．5 下一步研究计划

参考文献

附录

致谢