水稻染色质变构因子DDM1对DNA甲基化和基因表达的调控功能研究

摘要

基因组DNA包含了细胞的绝大部分遗传信息，在真核生物细胞中，DNA缠绕在组蛋白八聚体上形成核小体，核小体进一步凝聚成染色质。DNA和组蛋白上的共价修饰也会影响相应区段基因的转录，构成了DNA序列以外影响基因表达的另外一层信息。水稻基因组的重复序列和转座子元件占基因组的40％左右，并且很多转座子序列与基因相邻，而DNA甲基化主要发生在重复序列和转座子元件上，所有水稻中DNA甲基化对调控基因表达和生长发育非常重要。本博士论文详细地分析了水稻幼苗组织中基因组DNA甲基化图谱，研究了水稻染色质变构因子DDM1在维持基因组DNA甲基化中的功能以及调控水稻基因表达及生长发育的机制。
　　水稻中有两个DDM1的同源基因OsDDM1a和OsDDM1b，它们的蛋白质序列和CDS的一致性都非常高。我们得到两个基因的单突变体，并将osddm1a和osddm1b突变体杂交得到osddm1a/1b双突变体，与野生型相比单突变体没有明显表型变异，双突变体表型为植株变小，株高只有野生型的1/4左右，且雌雄不育，不能结实。对突变体和野生型发芽12天的叶片进行全基因组甲基化测序发现，osddm1a和osddm1b突变体DNA甲基化水平分别降低9.7％和16.5％，而双突变体总体甲基化降低了54％，其中CG、CHG和CHH(H=A、T和C)甲基化水平分别降低44.9％、73.5％和49.1％。
　　水稻基因组中CG和CHG甲基化主要分布在染色体着丝粒及周边区域（异染色质区域），CHH甲基化则在常染色质有更多的富集。非转座子基因的gene body及其3'-UTR和5'-UTR都有较高的CG序列甲基化，CHG和CHH序列甲基化主要分布在3'-UTR和5'-UTR，在osddm1a/1b双突变体中，基因中的CG、CHG和CHH序列的DNA甲基化都明显降低。转座子相关基因(TEGs)和转座子序列上有非常高的CG(＞80％)和CHG(80％左右)甲基化，在osddm1a/1b双突变体中CG(40％左右)和CHG(＜20％)甲基化降低非常显著。
　　在osddm1a/1b双突变体中，小转座子上CHH甲基化降低，而长的转座子上CHH甲基化增加。OsDRM2是CHH序列甲基转移酶，突变后导致全基因组CHH甲基化降低。比较两个突变体CHH甲基化的变化，发现常染色质CHH甲基化在osddm1a/1b双突变体和osdrm2突变体中都降低，osddm1a/1b双突变体中CHH序列甲基化降低的位点与osdrm2突变体CHH序列甲基化降低的位点完全重合，说明OsDDM1和OsDRM2共同参与常染色质CHH甲基化的维持。
　　我们对野生型和osddm1a/1b双突变体发芽12天的叶片进行转录组测序(RNA-seq)，研究DNA甲基化缺失对基因表达的影响。RNA-seq数据分析表明双突变体中表达上升4倍的基因有1453个，表达下调的有141个。表达上调的基因中有60％(859/1453)的基因属于TEGs，其中80.3％(687/859)的TEGs和34％(200/594)的非转座子基因CHG甲基化水平非常显著降低，表达上调非转座子基因有较高的H3K9me2修饰。说明OsDDM1主要通过维持CHG甲基化抑制转座子基因以及异染色质非转座子基因的表达。
　　osddm1a/1b双突变体中着丝粒区域和一些长的转座子上的CHH序列甲基化增加，说明OsDDM1抑制异染色质CHH甲基化。RNA介导的DNA甲基化途径(RdDM)参与CHH甲基化的起始和维持，sRNA在RNA介导的DNA甲基化途径中非常重要。我们对突变体和野生型材料进行sRNA测序(sRNA-seq)，分析osddm1a/1b双突变体中CHH甲基化的变化和sRNA的关系，发现osddm1a/1b双突变体中CHH甲基化的变化和24nt siRNA变化呈正相关的关系，osddm1a/1b突变体中CHH甲基化的变化与RdDM相关的。我们构建OsDDM1和RdDM途径的CHH甲基转移酶OsDRM2的突变体，对osddm1a/1b/drm2三突变体进行全基因组亚硫酸盐测序，分析发现三突变体中基因组总体DNA甲基化以及CG、CHG甲基化相对于osddm1a/1b有更加明显的降低，并且osddm1a/1b双突变体中增加的CHH甲基化在三突变体中也降低了，说明RdDM介导了osddm1a/1b中CHH甲基化的增加，OsDDM1和OsDRM2共同维持基因组的DNA甲基化。

目录

声明

摘要

缩略词表

1 前言

1．1 研究问题的由来

1．2 文献综述

1．2．1 表观遗传学的概念

1．2．2 表观修饰

1．2．3 染色质变构因子

1．2．4 表观调控

1．2．5 跨代表观遗传

1．3 研究目的及意义

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 水稻材料

2．1．2 菌株

2．1．3 质粒

2．1．4 抗体

2．1．5 基因序列信息获取和分析

2．2 实验方法

2．2．1 载体构建

2．2．2 农杆菌介导的水稻遗传转化

2．2．3 水稻叶片DNA抽提

2．2．4 RNA抽提

2．2．5 原核蛋白表达、纯化

2．2．8 His pull down

2．2．9 Western杂交

2．2．11 GUS染色

2．2．12 液相色谱和质谱联用检测DNA甲基化

2．2．16 转录组测序(RNA-seq)数据分析

2．2．17 LC-MS测量野生型和突变体基因组总体DNA甲基化水平

3 结果与分析

3．1．1 OsDDM1a和OsDDM1b两个基因非常同源，存在功能冗余

3．1．2 osddm1a、osddm1b突变体的鉴定及双突变体的构建

3．1．3 osddm1a／1b双突变体存在严重的生长发育缺陷

3．1．4 osddm1a／1b双突变体基因组DNA甲基化降低

3．1．5 BS-seq分析osddm1a、osddm1a和双突变体DNA甲基化

3．1．6 OsDDM1维持非转座子基因的CG、CHG、CHH甲基化

3．1．7 OsDDM1维持TE-related genes和TEs的CG、CHG甲基化，抑制长的TEs的CHH甲基化

3．1．8 OsDDM1突变体差异甲基化分析

3．1．9 OsDDM1突变对基因表达的影响

3．1．10 OsDDM1突变对sRNA表达的影响

3．1．11 osddm1a／1b突变体中增加的CHH甲基化是通过DRM2介导的

3．2 OsDDM1和CHR729共同调控苗期芽的产生

3．3 表观重组自交系的构建

4 讨论

4．1 水稻染色体上CHH甲基化和CG、CHG甲基化的分布不一致

4．2 水稻0sDDM1在CHH甲基化维持途径上扮演的角色

4．3 水稻osddm1a／1b突变体CHH甲基化和sRNA变化呈正相关

4．4 水稻osddm1a／1b突变体着丝粒CHH甲基化的增加对突变体着丝粒功能的影响

4．5 DNA混和池BS-seq克隆表观等位基因

参考文献

附录

作者简介

已发表的论文

会议摘要

致谢