土壤组分影响Bacillus subtilis自然转化的内在机制初探

摘要

为有效评估转基因生物释放到土壤环境中的生态安全性，需要全面了解土壤细菌发生自然转化的可能性。本文以土壤典型细菌枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和常见的三种粘粒矿物（高岭石、蒙脱石和针铁矿）及不同比例的矿物-腐殖酸复合体为材料，同时引入B.subtilis重要的感受态调控信号分子CSF(competence and sporulation stimulating factor)，探究了三种粘粒矿物及其与CSF的互作对B.subtilis自然转化的影响，结合矿物表面固定态质粒的转化能力和矿物对细菌代谢活性的影响结果，解释矿物影响B.subtilis自然转化的可能内在机制。并初步探究了不同比例的矿物-腐殖酸复合体及与CSF互作对B.subtilis的自然转化效率的影响，分析腐殖酸对B.subtilis自然转化的作用。获得如下主要结果:
　　1.制备了三种矿物表面吸附态质粒pHTG，与游离态质粒同时转化B.subtilis细胞。发现吸附在三种矿物表面的质粒pHTG仍然具有转化B.subtilis的能力，与游离态质粒相比转化效率降低。固定在针铁矿表面的质粒转化效率下降得最多，而蒙脱石和高岭石固定态质粒的转化效率下降得较少，表明针铁矿结合的质粒的转化活性最低。
　　2.研究了不类型和浓度的矿物对B.subtilis的自然转化的影响，同时比较了CSF与三种不同矿物相互作用后B.subtilis的自然转化情况。发现不同类型及浓度的矿物对B.subtilis的转化有不同的影响，较低浓度矿物条件下细菌的转化能力由高到低的顺序是高岭石＞针铁矿＞蒙脱石，而高浓度条件下的顺序是针铁矿＞蒙脱石＞高岭石。CSF与不同类型及浓度的矿物相互作用后对B.subtilis的自然转化效率的影响也不同，是因为矿物可通过影响信号分子CSF的生物有效性进而影响B.subtilis的转化。本研究认为当矿物浓度较低时，B.subtilis转化受到矿物对质粒DNA吸附和感受态形成的影响，而在较高浓度矿物存在条件下，矿物对B.subtilis转化的影响更多的是矿物与胞外信号分子互作对细菌感受态的影响，表明土壤颗粒与细菌感受态形成相关因子的互作是影响细菌自然转化的重要因素。
　　3.研究了三种矿物不同比例的矿物-腐殖酸复合体及其与CSF相互作用对B.subtilis自然转化的影响，初步分析了腐殖酸对B.subtilis自然转化的作用。发现与纯矿物相比，三种矿物与腐殖酸结合后对B.subtilis自然转化都有不同程度的促进作用，促进程度受到腐殖酸含量的影响。
　　上述结果有助于我们了解土壤组分对B.subtilis自然转化效率的影响，为评估工程菌在环境中应用的生态风险提供理论参考。

目录

声明

摘要

缩略词表(Abbreviation)

第一章 前言

1．1 土壤环境中的水平基因转移

1．1．1 土壤中DNA分子的来源

1．1．2 DNA分子的命运和生态学功能

1．1．3 细菌自然遗传转化

1．2 群体感应与信号分子

1．2．1 细菌群体感应调控系统及机制

1．2．2 群体感应的应用

1．2．3 群体感应调控的B．subtilis自然感受态的形成

1．3 研究目标和内容

第二章 矿物对B．subtilis生长代谢及pHTG转化活性的影响

2．1 引言

2．2 材料与方法

2．2．1 菌株与质粒

2．2．2 培养基与试剂

2．2．3 抗生素

2．2．6 矿物胶体悬液的制备

2．2．7 B．subtilis转化细胞的准备

2．2．8 质粒pHTG的小量提取

2．2．9 质粒pHTG的大量提取

2．2．10 聚乙二醇沉淀法纯化质粒

2．2．11 固定态质粒的制备

2．2．12 B．subtilis生长曲线的测定

2．2．13 阳性转化子的检测

2．2．14 等温微量热技术研究矿物对B．subtilis代谢活性的影响

2．2．15 固定态质粒pHTG的转化活性及抗核酸酶的降解

2．3 结果与分析

2．3．1 B．subtilis的生长曲线

2．3．2 阳性转化子的检测

2．3．3 矿物对枯草芽孢杆菌代谢活性的影响

2．3．4 矿物表面固定态质粒pHTG的转化活性及抗核酸酶降解能力

2．4 讨论

第三章 矿物及与CSF互作体系中B．subtilis的自然转化

3．1 引言

3．2 材料和方法

3．2．1 菌株与质粒

3．2．2 培养基与试剂

3．2．3 信号分子CSF

3．2．4 质粒pHTG的准备

3．2．5 矿物胶体的提取和矿物悬液的制备

3．2．6 B．subtilis转化细胞的准备

3．2．7 HPLC检测CSF的工作曲线

3．2．9 不同类型和浓度的矿物体系中B．subtilis 168的自然转化

3．2．10 CSF和矿物互作体系中B．subtilis 168的自然转化

3．2．11 矿物对信号分子CSF调控srfA基因表达的影响

3．3 结果与分析

3．3．1 CSF的工作曲线

3．3．2 不同浓度CSF体系中B．subtilis 168的自然转化

3．3．3 不同浓度的矿物体系中B．subtilis 168的自然转化

3．3．4 CSF和矿物互作体系中B．subtilis 168的自然转化

3．3．5 矿物对CSF调控srfA基因表达的影响

3．4 讨论

第四章 矿物-腐殖酸复合体及与CSF互作体系中B．subtilis的自然转化

4．1 引言

4．2 材料和方法

4．2．1 菌株与质粒

4．2．1 培养基与试剂

4．2．3 矿物胶体的提取

4．2．4 腐殖酸

4．2．5 不同比例的矿物-腐殖酸复合体的制备

4．2．6 质粒pHTG的准备

4．2．7 B．subtilis 168转化细胞的准备

4．3．2 不同比例的矿物-腐殖酸复合体体系中B．subtilis 168的自然转化

4．3．3 CSF与矿物-腐殖酸复合体互作体系中B．subtilis 168的自然转化

4．4 讨论

5．1 主要结论

5．2 创新点

5．3 研究展望

参考文献

致谢