恶臭假单胞菌KT2440中(p)ppGpp对生物被膜形成的调控作用

摘要

恶臭假单胞菌KT2440是环境微生物研究中的一株模式菌株，具有普遍认可的生物安全性，多年来作为研究材料被用于研究有机污染物的生物降解、细菌的重金属耐受性、细菌与植物互作以及细菌生物被膜和游动性调控等。作为细菌的一种生存策略，形成生物被膜能有效提高细菌的物质分解能力和抗逆能力，使细菌对多变的环境具有更强的适应性，因此研究细菌生物被膜的调控模式对于理解细菌与环境的关系具有重要意义。(p)ppGpp是细菌用于响应营养饥饿和部分环境刺激的信号分子，在细胞中具有全局性的调控作用，对提高细菌在环境胁迫中的生存能力同样起到关键性的作用。在多种病原微生物和肠道微生物中，(p)ppGpp对生物被膜的调控起着重要作用，但是在环境微生物中却缺乏相关的报道。
　　本文研究了(p)ppGpp在KT2440生物形成过程中所发挥的作用以及胞外多糖Pea的功能和基因的表达调控，获得以下结果:
　　1、KT2440中负责(p)ppGpp代谢的酶有两个，分别是具有合成酶活性的RelA和既有弱合成酶活性也有水解酶活性的SpoT。我们发现单独缺失relA对KT2440的生物被膜表型不会造成明显的影响，但是当同时敲除relA和spoT，KT2440在固体表面上形成生物被膜的能力显著增强，但是在气液界面所形成的生物被膜却变得松散脆弱，而且经过长时间培养后，两种生物被膜均不能正常消散。此外，relA-spoT突变体在盖玻片上的粘附能力明显增强，可是不能正常形成微菌落。
　　生物被膜形成过程中的粘附和发育以及生物被膜结构的构建均与胞外基质中的胞外多糖和粘附蛋白密切相关。首先通过对多聚糖的定量，我们发现relA突变体和relA-spoT突变体均能产生更多的多聚糖，虽然relA突变体和relA-spoT突变体的多聚糖总产量相似，但是只有relA-spoT突变体的菌斑变得光滑湿润，因此造成菌斑形态变化的原因似乎不是多聚糖总产量的提高，而可能是不同的多糖产量发生改变。接着我们检测了四个胞外多糖合成基因簇在突变体中的表达水平，发现alg表达水平未发生变化，peb和bcs的表达量有一定程度的上升，但是pea的表达水平却大幅下降，这些变化在relA-spoT突变体中均比在relA突变体中强烈，推测光滑菌斑的形成是由于缺乏Pea多糖。另外，检测了粘附蛋白编码基因lapA和lapF的表达水平后，发现lapA的表达显著上升，而lapF呈现相反的趋势。根据已知的关于各个胞外多糖和粘附蛋白的功能，我们认为lapA表达上升是relA-spoT突变体生物被膜增多和粘附能力增强的原因，LapF和Pea的不足可能导致了突变体不能形成微菌落和液面生物被膜结构的缺陷。为了更好地阐述(p)ppGpp对胞外基质组分相关基因表达的影响，我们检测了与之直接相关的调控因子的表达变化，发现在relA-spoT突变体中fleQ的表达显著上升，而rpoS则是显著下降。在缺乏(p)ppGpp的情况下，σ因子RpoS的表达和功能发挥受抑制，导致lapF表达下降，同时促进了转录上依赖σ因子RpoD的fleQ表达，表达量上升的FleQ促进lapA的转录，虽然FleQ能抑制bcs的表达，但是高水平c-di-GMP能解除这种抑制作用，促进bcs表达。
　　2、有研究显示Pea多糖与生物被膜的稳定性和液面生物被膜的形成有关，但是pea的表达模式至今未被阐明。为了更好地解释生物被膜表型和pea表达水平在relA-spoT突变体中的变化，我们探究了Pea的功能与基因的表达调控。我们发现pea基因簇从一个位点开始转录，该转录起始位点位于基因簇首个基因的起始密码子前面25bp，随后发现pea的转录依赖于σ因子RpoS，推测pea在relA-spoT突变体中的表达下降是RpoS的表达水平降低所致。在rpoS突变体中，另一个σ因子似乎也能介导pea转录，可是此时pea的转录水平非常低，根据点突变启动子转录活性的结果，这个σ因子极可能是RpoD。生物被膜的检测结果显示，缺失pea虽然不影响生物被膜形成的初始阶段，但在后续阶段影响了生物被膜的发育，使生物被膜产量相对降低。另外，pea突变体完全丧失了形成液面生物被膜的能力，虽然lapF也是一个转录依赖于RpoS的胞外基质基因，但是lapF突变体的生物被膜表型与野生型菌株的相比没有明显差异，表明影响液面生物被膜形成的关键基质成分是Pea而不是LapF，并且relA-spoT突变体气液界面生物被膜的缺陷很可能是因为Pea多糖在该突变体中的产量降低。Pea多糖还是形成由高水平c-di-GMP介导的褶皱菌斑的必要因素，含高水平c-di-GMP的rpoS突变体也能形成褶皱菌斑，但是比野生型菌株的明显要弱，这可能是由于RpoD也能激活pea低水平的表达，而这种低表达量也能在高水平c-di-GMP条件下促使褶皱菌斑的形成。此外，我们还鉴定出pea基因簇的表达受到调控因子AmrZ的抑制，通过EMSA和DNaseⅠ足迹实验发现AmrZ直接结合到pea启动子的-10区至-35区的序列上，AmrZ可能通过在此位点的结合来抑制RNAP全酶对启动子的识别与结合，抑制转录的起始，实现对pea表达的调控。

目录

声明

摘要

缩略语表

1 前言

1．1 细菌中的第二信使(p)ppGpp

1．1．1 细菌的核苷类第二信使

1．1．2 细菌中(p)ppGpp的合成与水解

1．1．3 (p)ppGpp对DNA复制的调控

1．1．4 (p)ppGpp对基因转录的调控

1．1．5 (p)ppGpp对蛋白质翻译的调控

1．1．6 (p)ppGpp与σ因子RpoS的关系

1．1．7 (p)ppGpp对细菌生理的影响

1．1．8 (p)ppGpp与生物被膜调控

1．2 恶臭假单胞菌KT2440生物被膜的组成及调控

1．2．1 恶臭假单胞菌KT2440的介绍

1．2．2 恶臭假单胞菌的胞外多糖

1．2．3 恶臭假单胞菌的胞外粘附蛋白

1．2．4 生物被膜的形成

1．2．5 生物被膜的消散

1．2．6 生物被膜与细菌的生存

1．2．7 生物被膜中的细菌群体关系

1．3 研究目的和意义

2 材料和方法

2．1 材料

2．1．1 菌株与质粒

2．1．2 主要试剂和药品

2．1．3 培养基及常用溶液的配制

2．2 方法

2．2．1 菌株培养

2．2．2 工具载体的构建

2．2．3 大肠杆菌热激感受态细胞的制备及热激转化

2．2．4 两亲本杂交

2．2．5 电激转化感受态细胞的制备及电激转化

2．2．6 基因缺失突变体的构建

2．2．7 生物被膜的培养与检测

2．2．8 刚果红吸附能力的检测

2．2．9 总多糖的提取与定量

2．2．10 总RNA的提取

2．2．11 qRT-PCR检测基因表达水平

2．2．12 基因转录起始位点的鉴定

2．2．13 β-半乳糖苷酶活性的测定

2．2．14 定点突变DNA碱基序列

2．2．15 蛋白的诱导表达、纯化及浓度测定

2．2．16 凝胶迁移电泳实验

2．2．17 DNase I足迹实验

3 结果与分析

3．1．2 构建relA和relA-spoT突变体

3．1．3 (p)ppGpp对KT2440生物被膜形成能力的影响

3．1．4 (p)ppGpp对KT2440表面粘附的影响

3．1．5 (p)ppGpp相关突变体气液界面生物被膜的形态

3．1．6 (p)ppGpp对胞外多糖产量的影响

3．1．7 胞外多糖基因在(p)ppGpp相关突变体中的表达情况

3．1．8 粘附蛋白基因在(p)ppGpp相关突变体中的表达情况

3．1．9 (p)ppGpp对调控因子FleQ和RpoS表达的影响

3．2 胞外多糖合成基因簇pea的表达调控

3．2．1 构建rpoS、pea、lapF、pea-lapF、amrZ突变体

3．2．2 对pea基因簇启动子区的分析

3．2．3 RpoS调控pea转录

3．2．4 c-di-GMP介导的褶皱菌斑依赖Pea多糖

3．2．5 Pea多糖在生物被膜发育中的作用

3．2．6 预测pea启动子区域的AmrZ结合位点

3．2．7 AmrZ抑制pea的表达

3．2．8 AmrZ直接结合pea启动子

4 讨论与总结

4．1 讨论

4．1．1 (p)ppGpp对生物被膜的调控作用-讨论

4．1．2 (p)ppGpp与生物被膜的消散-讨论

4．1．3 胞外多糖合成基因pea的调控与功能-讨论

4．2 总结

5 展望

参考文献

附录

致谢