基于RNAi的橘小实蝇雄性不育技术研究

摘要

橘小实蝇，Bactrocera dorsalis(Hendel)，作为一种东南亚普遍存在的毁灭性害虫，能危害超过250种水果蔬菜，造成严重的经济损失。相对于化学农药防治，雄性不育技术(Sterile insect technique，SIT)防治橘小实蝇具有特异性高、环境友好的显著优势。传统的SIT方法通过辐射或化学不育剂实现，但由于其降低雄虫交配能力、生存力、免疫力等生物性能而限制了害虫防控效果。近期出现的基于遗传干扰技术(例如RNAinterference(RNAi))的SIT却展现出巨大的害虫防治应用潜力。RNAi是一种由dsRNA启动的保守基因表达抑制机制，已成功应用于功能基因组、医药、农业，以及害虫防控研究领域。虽然RNAi技术已经在众多农业害虫中成功实现，但在田间实际应用之前仍需要克服诸多使用技术问题。为了开发基于RNAi的SIT技术用于防控橘小实蝇，本研究首先筛选了精子形成关键基因，并验证了其RNAi的雄性不育效果。为了进一步提高dsRNA稳定性和干扰效果，本研究开发了关键基因（Boul）的dsRNA的纳米颗粒包装技术，筛选出最佳的物质配比和pH值条件，并验证其对基于RNAi的雄性不育技术的改进效果。最后，我们应用Sf9细胞系在细胞水平上研究了最佳制备条件(pH=6.5，Chitosan∶dsRNA=1∶4)下纳米材料包装的dsBoul对昆虫细胞的影响。
　　1.诱导橘小实蝇雄虫不育的RNAi靶标基因
　　第一部分研究中，我们通过RNA干扰橘小实蝇雄虫候选生殖细胞分化和精子缺失相关基因，再检测其与正常雌虫交配产卵等繁殖力，研究筛选了诱导雄虫不育的RNAi靶标基因。结果表明在喂食dsRNA处理后，橘小实蝇雄虫中靶基因(Boul,ZPG，dsxM,FZO and Gas8)的表达水平显著降低，并严重影响雄性的生殖能力，与对照组（dsEgfp）相比，卵孵化率降低60％-75％。不同基因dsRNA进行不同组合(Boul+ZPG,Boul+dsxM and ZPG+dsxM)干扰试验表明，发现其RNAi可以进一步提升雄性不育效果，其中最佳组合Boul+ZPG可造成86％的雄性不育。最佳的Boul+ZPG dsRNA组合不同使用浓度试验结果表明250，500，750和1000ng/ul分别造成了20.1％,39.63％,59.24％和86.28％的雄性不育;不同日龄的雄虫RNAi处理后表明1、5、7、10日龄雄虫的不育比例分别为86.28％,34.14％,22.60％和10.83％。这些结果表明在最佳dsRNA组合下进行RNAi，可显著减少雄虫的精子和活精子的数量。我们的研究有助于在B.dorsalis中发展基于RNAi的新型SIT技术用于防控橘小实蝇。
　　2.橘小实蝇dsboul壳聚糖纳米颗粒包装释放技术
　　在第二部分研究中，我们进一步开发了dsRNA的纳米颗粒包装释放技术。针对雄性不育效果最好的Boul基因，我们比较了两种纳米颗粒制备方法:1）嵌入法，2)吸收法;同时比较了三种pH值（6.5，7.5和8.5）条件。qRT-PCR结果表明，pH的变化可以显著影响dsBoul的RNAi效率。RNAi处理后持续25d的观察结果表明在pH=6.5条件下嵌入法制备的dsRNA纳米颗粒的RNAi效率最高，尤其是在第5天的Boul基因表达水平仅为对照组的0.22倍。而吸收法制备的dsBoul纳米颗粒处理15，20，25天后的基因表达水平与嵌入法制备的无显著差异。在此之后，我们分别使用嵌入法和吸收法，在pH6.5条件下使用了不同质量比(1∶1，1∶2，1∶3，1∶4)的壳聚糖:dsRNA组合进行纳米颗粒制备用于RNAi喂食处理。嵌入法制备条件下，质量比为1∶4的壳聚糖:dsRNA组合制备纳米颗粒处理25天后基因表达水平显著低于处理组（0.6倍），而吸收法制备条件下，不同壳聚糖:dsRNA组合制备的纳米颗粒处理后皆与对照组无显著性差异。在最适pH6.5条件下，我们进一步比较了物质配比(Chitosan∶dsRNA)为1∶1，1∶2,1∶3，1∶4条件下的效果，发现在两种包装技术条件下，1∶4物质配比的效果皆优于其它配比条件，且嵌入法效果优于吸收法。两种包装技术方法对chitosan纳米颗粒尺寸的影响研究结果表明:嵌入法产生的纳米颗粒尺寸约为80nm，优于吸收法（约为110nm）。因此在pH6.5和1∶4物质配比条件下嵌入法被进一步用于后面一系列生物测定并验证SIT相关基因的功能。与对照组(Chitosan/dsEgfp)和无纳米材料包装的dsBoul相比，处理组导致卵孵化减少77％以上，而产卵量差异不显著。在处理14天后进行雄性橘小实蝇精囊中精子总数的定量，发现进行Chitosan/dsBoul处理的雄性橘小实蝇的精子平均数目显著减少;而精子活力测定则显示处理组的活精子百分比仅为约20％，显著低于对照水平。这些结果表明纳米材料处理显著提高了dsRNA的稳定性和RNAi效率。
　　3.纳米材料包装的dsBoul对昆虫细胞的影响
　　最后，我们检测了嵌入法制备的dsBoul纳米颗粒材料(Chitosan∶dsRNA=1∶4)对sf9细胞系的影响。通过流式细胞分析技术发现Chitosan/dsBoul处理导致细胞凋亡，且细胞周期停滞在G2期。此外，通过多种细胞死亡率分析和透射电子显微镜(TEM)技术证明Chitosan/dsBoul可诱导Sf9细胞畸形。这些结果表明dsBoul可显著影响sf9细胞系，使细胞停滞于G2期。

目录

声明

CONTENTS

摘要

ABSTRACT

List of Abbreviations

CHAPTER：1 GENERAL INTRODUCTION AND LITERATURE REVIEW

1．2．1 Cultural controls

1．2．2 Insecticide cover sprays

1．2．3 Protein bait sprays

1．2．4 Male annihilation technique

1．2．5 Release of natural enemies

1．2．6 Sterile insect technique

1．3 RNAi-based SIT

1．3．1 Types of RNAi

1．3．2 Different RNAi pathways and their components

1．3．3 RNAi efficiency

1．3．4 Systematic properties of dsRNA

1．3．5 Mechanism of transmembrane channel-mediated uptake of dsRNA

1．3．6 Mechanism of endocytosis-mediated dsRNA uptake

1．4 Role of scavenger receptors in dsRNA uptake

1．4．1 Role of endocytic pathways in dsRNA efficiency

1．4．3 RNA-dependent and RNA polymerase

1．5 RNAi in insect pest control

1．5．1 Concentration of dsRNA

1．5．2 Nucleotide sequence

1．5．3 Length of the dsRNA fragment

1．5．4 Persistence of the silencing effect

1．5．5 Life stage of the target organism

1．6 Role of Nanoparticles in RNAi

1．6．1 Chitosan Nanoparticles

1．6．2 General characteristics of chitosan functional features Structure，physicochemical properties and source

1．6．3 Structure-property relationship

1．7 Cen line experiments

1．8 Thesis objectives

CHAPTER 2：The target genes for producing Bactrocera dorsalis sterile males based on RNAi

2．1 Introduction

2．2 Materials and Methods

2．2．1 Insects Rearing

2．2．2 The Experimental equipment

2．2．3 Commonly used antibiotics，medium and buffer preparation

2．2．4 Strains and plasmids

2．2．5 The main reagents and kits

2．2．6 Experimental methods

2．3 Results

2．3．1 Selection of testes specific genes

2．3．2 Toral RNA extraction from the B．dorsalis

2．3．3 Cloning of selected genes

2．3．4 Gene silence effects using RNAi

2．3．5 Screening of target genes for SIT based on male sterility

2．3．6 Effects of solely effect of selected genes on male sterility

2．3．7 Effects of combination of different genes on male sterility

2．3．8 Technique factors for SIT based on best dsRNA combination

2．3．9 Effect of RNAi on Spermatozoa and live／dead sperm of fruit flies

2．4 Discussion

Chapter 3 Delivery techniques of dsBoul／chitosan nano-particles in Bactrocera dorsalis

3．1 Introduction

3．2 Material Methods

3．2．1 Preparation of dsRNA

3．2．4 Preparation of dsRNA／chitosan with absorbing method at different pH

3．2．6 Effect of temperature on dsRNA／Chitosan with embedding method

3．2．8 Effect of screened dsRNA mass ratios on nano-particle size

3．2．9 Gene functioning of target gene dsRNA

3．3 Results

3．3．1 Effect of PH on dsRNA stability

3．3．2 Effect of dsRNA mass ratio on stability

3．3．3 Stability assay after preparation of dsRNA／Chitosan with embedding method

3．3．4 Stability assay after preparation of dsRNA／Chitosan with absorbing method

3．3．5 Particle Size

3．3．6 Effects of Nanoparticle／dsRNA effect on male sterility

3．3．7 Number of Spermatozoa and live／dead sperm assay

3．4 Discussion

Chapter 4 Effects of Chitosan／dsBoul treatment on sf9 cell line

4．1 Introduction

4．2 Materials and Methods

4．2．1 Chemical and Reagents

4．2．2 Cell Culture and Chitosan／dsBoul Treatment

4．2．3 Ultrastructural Morphological Investigation

4．2．4 Cell Cycle Analysis

4．2．5 Cell Apoptosis Detection by Double Staining Annexin V-FITC／PI Assay

4．2．8 Live／Dead Viability assay of Chitosan／dsBoul

4．3 Results

4．3．1 Cell cycle progression induced by Chitosan／dsBoul

4．3．2 Apoptosis induction by Chitosan／dsBoul

4．3．3 DNA Fragmentation induction by Chitosan／dsBoul

4．3．4 The expression of Cell cycle and apoptosis related protein

4．3．5 Influence of Chitosan／dsBoul on number of live／dead cells

4．3．6 Chitosan／dsBoul induce Nucleus，Mitochondria and Cell Membrane Ultra structure

4．4 Disscusion

5．SUMMARY

5．1 Innovations

5．2 Future perspectives

REFERENCES

ACKNOWLEDGEMENTS