塞内卡谷病毒分离鉴定及其3C蛋白酶拮抗干扰素产生的分子机制

摘要

塞内卡谷病毒（Seneca valley virus，SVV）属于小RNA病毒科塞内卡病毒属成员，与心肌炎病毒属成员的遗传关系最近。近年发现SVV与猪特发性水疱病(Porcine idiopathic vesicular disease，PIVD)和流行性新生儿暂时性死亡(Epidemic transient neonatal losses，ETNL)等新病原相关，感染猪临床表现为跛行，水疱并伴有精神沉郁、厌食，新生仔猪病死率高达30％～70％。自2014年以来，在全球多个国家报道了SVV感染所致PIVD的病例。我国广州一家猪场首次报道SVV感染，随后在湖北、黑龙江、河南、福建和广东等地陆续出现SVV感染病例。
　　作为猪新发的传染病病原，目前对其与宿主的抗病毒相互作用关系知之甚少。SVV是如何导致猪体发病，急需从各个层面进行解析其致病机理。鉴于此，本研究从病毒的分离鉴定、SVV感染性克隆的构建以及SVV对宿主抗病毒天然免疫的调控三方面进行了研究。具体内容如下:
　　1.SVV的分离与鉴定
　　从临床疑似SVV感染的特发性水疱病仔猪中采集水疱液，对可造成猪只水疱性疾病的重要病原，如水疱性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus，VSV)，口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus，FMDV)和猪水疱病病毒(Swine vesicular disease virus，SVDV)进行病原特异性PCR检测，结果扩增出特异性目的带，测序结果表明与SVV高度同源，表明该临床病例由SVV感染导致。随后，利用BHK-21细胞对SVV进行病毒分离，获得了可引起BHK-21细胞发生典型细胞病变，在感染BHK-21细胞48小时后可产生直径为1～3毫米的病毒噬斑，利用SVV VP1蛋白多克隆抗体对病毒样品进行免疫荧光和蛋白印记检测，结果均显示为VP1反应阳性。在电子显微镜下可以观察到直径为26-30nm无囊膜的病毒粒子。综合这些结果表明我们分离到的病毒为SVV，并命名为SVV HB-CH-2016。
　　在获得SVV HB-CH-2016后，我们设计多条特异性的引物进行其全基因组扩增，将扩增的片段亚克隆入pEasy-Blunt载体中进行测序。结果表明，SVV HB-CH-2016全长基因组为7300bp，包括668bp的5'非编码区，一个编码2181个前体多聚蛋白的开放阅读区以及86bp具有polyA特性的3'非编码区。全基因组已提交于GeneBank，登录号为KX377924。
　　2.CMV启动子驱动的SVV感染性克隆的建立
　　本研究中以pBluescript SKⅡ为载体，建立了由CMV启动子介导转录的SVV HB-CH-2016株的感染性克隆质粒，命名为pSKⅡ-CMV-SVV/HB。转染质粒pSKⅡ-CMV-SVV/HB于293T或BHK-21细胞，36小时后可观察到类似SVV感染的细胞病变效应。免疫荧光检测、蛋白印记和特异性PCR进行检测。结果表明，成功地拯救出SVV(rSVV)。病毒噬斑检测结果表明rSVV和野生型SVV在BHK-21细胞上产生的噬斑大小无差异。上述结果表明成功建立了CMV驱动的SVV感染性克隆平台，为SVV相关病毒特性、病毒载体和新型病毒疫苗等研究奠定了基础。
　　3.SVV感染负调控Ⅰ型干扰素的产生
　　本研究首先利用双荧光素酶活性报告系统和实时荧光定量PCR探究了SVV感染对干扰素产生的影响，结果发现SVV感染不能激活干扰素IFN-β启动子活性和IFN-βmRNA的产生。通过对IRF3活性的检测也发现SVV不能有效的诱发IRF3发生磷酸化以及细胞核转运。此外，IFN-β处理实验结果发现，IFN-β可显著抑制SVV的增殖。以上结果表明，SVV是一个干扰素敏感的病毒，但是SVV感染不触发宿主干扰素产生应答。这暗示，SVV可能通过某种机制逃避宿主的抗病毒免疫应答。
　　4.SVV3Cpro负调控宿主Ⅰ型干扰素的产生
　　构建SVV蛋白的表达质粒，利用双荧光素酶活性报告系统和实时荧光定量PCR探究了SVV感染对干扰素产生的影响。结果显示SVV VP2，3Cpro和3D均不同程度抑制了Sev对IFN-β启动子的激活，3Cpro抑制效应极显著(P＜0.001)。实时荧光定量PCR检测、IRF3核转运、磷酸化IRF3蛋白水平等证实SVV3Cpro对IFN-β产生的负调控作用。以上结果证实，SVV3Cpro能有效拮抗宿主Ⅰ型干扰素的产生。
　　5.SVV3Cpro靶向拮抗Ⅰ型干扰素产生的分子机制
　　通过双荧光素酶系统检测IFN-β的启动子活性，发现SVV3Cpro效应区间位于RIG-1/MDA-5通路与IRF3上游之间。将天然免疫信号通路相关接头分子分别与SVV HA-3C共转染293T细胞，Western blot结果表明，SVV3Cpro特异性切割MAVS，TRIF和TANK。蛋白降解途径相关抑制剂MG132、NH4C1和Z-VAD-FMK均不能抑制SVV3Cpro对MAVS、TRIF和TANK的切割效应。酶活性缺失突变体结果显示SVV3Cpro对MAVS、TRIF和TANK切割效应依赖其蛋白酶活性。免疫共沉淀(Co-IP)和细胞内激光共聚焦观察定位分析结果显示SVV3Cpro与MAVS，TRIF和TANK存在相互作用。
　　依据SVV3Cpro裂解病毒多聚前体蛋白的识别位点，构建了MAVS、TRIF和TANK的一系列潜在切割位点突变体，Western blot检测对各个蛋白的切割情况。结果显示SVV3Cpro分别在Q148和Q159氨基酸残基切割MAVS和TRIF，而在E272和Q291对TANK进行了两次切割。上述结果表明，MAVS、TRIF和TANK的切割位点突变体可抵御SVV3Cpro的切割效应，保持其对IFN-β的激活作用;而MAVS和TANK的任何切割产物都失去了对IFN-β的激活作用;TRIF切割后其N端产物失去激活IFN-β产生的作用，但其C端产物仍然具有活性。
　　此外，SVV感染后可上调NF-κB信号通路依赖的炎性细胞因子IL-6和TNFαmRNA的转录。SVV3Cpro的表达可增强Sev感染对NF-κB信号通路的激活作用。SVV3Cpro介导的TANK切割可促进TRAF6诱导的NF-κB信号通路的激活。
　　综上所述，本研究从临床疑似PIDV病例中分离一株SVV;建立了SVV的感染性克隆;证实SVV3Cpro通过特异性切割宿主抗病毒天然免疫相关重要接头分子MAVS、TRIF和TANK，负调控Ⅰ型干扰素的产生，从而逃避宿主的抗病毒免疫。3Cpro对TANK的切割也促进了TRAF6介导的NF-κB信号通路的激活，这与SVV感染激活宿主NF-κB信号通路，诱发炎性细胞因子的产生存在重要相关性。

目录

论文说明

声明

摘要

缩略语表(ABBREVITION)

第1章 文献综述

1．1 塞内卡谷病毒(Seneca valley virus，SVV)研究进展

1．1．1 塞内卡谷病毒分子生物学特征

1．1．2 塞内卡谷病毒感染宿主

1．1．3 塞内卡谷病毒流行现状

1．1．4 塞内卡谷病毒发病机制

1．1．5 塞内卡谷病毒的鉴别诊断

1．1．6 预防和控制管理

1．2 RIG-I样受体(RIG-I-like receptors，RLRs)介导的抗病毒信号转导

1．2．1 RLRs成员及其功能

1．2．2 RLRs介导的信号转导

1．2．3 MDA5特异性识别小RNA病毒核酸

1．2．4 小RNA病毒与宿主抗病毒天然免疫反应的相互作用

第2章 研究目的与意义

第3章 材料与方法

3．1 实验材料

3．1．1 工程菌、细胞和病毒

3．1．2 克隆载体和表达质粒

3．1．3 主要药品和试剂

3．1．4 主要培养液及其配制

3．1．5 主要缓冲液与相关试剂及其配制

3．2 实验方法

3．2．1 病料的采集、处理与检测

3．2．2 病毒的分离鉴定

3．2．3 病毒的增殖

3．2．4 病毒噬斑实验

3．2．5 病毒粒子电镜观察

3．2．7 rSVV的拯救

3．2．8 病毒生长曲线的绘制

3．2．11 制性内切酶酶切反应

3．2．12 DNA凝胶电泳与纯化回收

3．2．13 PCR或酶切产物回收与纯化

3．2．15 大肠杆菌感受态细胞的制备

3．2．16 连接产物的转化

3．2．17 质粒DNA的小量制备

3．2．18 细胞的传代

3．2．19 瞬时转染

3．2．20 免疫共沉淀实验

3．2．21 免疫印迹实验

3．2．22 免疫荧光与激光共聚焦显微镜观察

3．2．23 实时荧光定量PCR检测

3．2．24 双荧光素酶报告基因实验

3．2．25 药物处理

3．2．26 统计学方法

第4章 结果与分析

4．1．1 疑似SVV感染病料样品的检测

4．1．2 病料样品的病毒分离鉴定

4．1．4 SVV HB-CH-2016全基因组序列测定与分析

4．2 SVV感染性病毒粒子的拯救

4．2．2 SVV感染性病毒粒子(rSVV)的拯救

4．2．3 rSVV的生长曲线测定

4．3 塞内卡谷病毒拮抗宿主Ⅰ型干扰素产生的分子机制研究

4．3．1 SVV感染不能激活Ⅰ型干扰素的产生

4．3．2 SVV 3Cpro抑制Sev诱导IFN-β的产生

4．3．3 SVV 3Cpro靶向MAVS，TRIF和TANK来拮抗Sev诱导的Ⅰ型干扰素产生

4．3．4 SVV 3Cpro介导的MAVS，TRIF和TANK的切割取决于其蛋白酶活性

4．3．5 SVV 3Cpro与MAVS，TRIF和TANK互作

4．3．6 SVV 3Cpro在特定位点切割MAVS，TRIF和TANK

4．3．7 MAVS，TRIF和TANK的切割片段失去其诱导Ⅰ型干扰素产生的功能

4．3．8 SVV 3Cpro介导的TANK切割促进TRAF6触发的NF-κB活化

第5章 讨论与结论

5．1 讨论

5．1．2 CMV启动子驱动的SVV感染性克隆的建立

5．1．3 SVV拮抗宿主Ⅰ型干扰素产生的分子机制研究

5．2 结论

参考文献

附录

致谢