植物ICKs在大孢子发生和雌配子体形成过程中的功能分析

摘要

ICKs/KRPs(Inhibitors of cyclin-dependent kinase/Kip-related proteins，以下简称ICKs)是植物细胞周期蛋白依赖性激酶(Cyclin-dependent Kinase，CDK)的抑制因子，能抑制细胞周期进程和细胞分裂进而在细胞周期调控中起着重要作用。拟南芥基因组中有7个ICK基因，由于成员之间功能上的冗余性，目前对植物中ICK基因家族的功能以及各成员之间的功能特异性还缺乏深入了解。本实验室先前对ICK1/2/5/6/7的T-DNA插入五突变体进行了研究。本研究旨在创建ICK T-DNA插入六突变体和七突变体的基础上，系统研究ICK基因家族所有成员的敲除对植物生长发育的影响。
　　对一个拟南芥六突变体ick123567和七突变体（所有ICK基因被敲除）表型分析显示，与五突变体ick12567和野生型相比，七突变体的植物幼苗鲜重和粒重显著增加。多种非生物胁迫处理，包括植物生长素、细胞分裂素、脱落酸、氯化钠、蔗糖、paraquat和S-甲基甲烷硫代磺酸，野生型和七突变体的根长及生长量之间的差异不显著。
　　ICK七突变体角果变短、每个角果种子数减少。细胞学观察发现，七突变体中有47％的胚珠败育，而五突变体ick12567、六突变体ick123567和野生型中胚珠正常。正反交结果显示七突变体作为母本时才能观察到短角果的表型，说明这个表型是由于雌配子体发育缺陷造成的。对处于雌配子体发育第7时期(FG7)的胚囊发育观察表明，野生型胚囊在授粉之前三个反足细胞降解;而七突变体胚囊中除了正常的配子外，还有额外的细胞核，这些细胞核可以被区分为是具有一个卵细胞、一个中央细胞和两个助细胞的两套、三套或者四套的配子体，不同配子体间有时可见清楚的界限，表明突变体胚珠中有多个独立的胚囊存在。利用卵细胞标记pEC1.1::GUS和中央细胞标记pFIS2::GUS确定了七突变体胚珠中多个卵细胞和中央细胞的存在。
　　功能大孢子时期，野生型胚珠只观察到一个功能大孢子。七突变体中，有30％的胚珠观察不到功能大孢子，而其余70％胚珠中可观察到1-3个功能大孢子，极少胚珠中有4个。在FG2时期，野生型胚囊中有一对典型的细胞核，七突变体中有1-4对细胞核，每对细胞核之间界限分明。但在2-Ⅰ阶段的胚珠中，野生型和七突变体中均只有一个大孢子母细胞。这些结果说明，七个ICK基因的敲除导致多个功能大孢子的形成并且能继续发育成多套雌配子体。
　　开花后三天，野生型胚珠有一个胚和形态一致且分布在整个胚囊中的胚乳细胞核，而在七突变体胚珠中观察到胚乳中有不同类型的细胞核，或两个或三个独立的胚乳囊室，并且有双胚的存在。在携带pEC1.1::GUS标记的七突变体开花后三天的胚珠中，除了胚能观察到GUS染色外，在合点端有1-2个不同的点也可观察到GUS染色，说明受精后三天胚珠中没有受精的额外卵细胞依然存活在胚囊中。与双胚发育一致，七突变体中有2％的种子可以观察到双胚苗。经野生型和携带有中央细胞标记(pFIS2::GUS)的七突变体混合花粉授粉的七突变体，其后代中双胚苗的基因型检测发现每一对双胚苗具有相同或不同的基因型，表明双胚苗是两个卵细胞分别接受两个不同花粉管所释放的精子细胞经受精产生的。
　　互补实验证明，单个ICK4或ICK7基因组片段导入七突变体中均能回复其突变表型。本研究证明了ICK基因不仅调控植物生长的细胞周期调控，还在非功能大孢子细胞的退化过程起重要作用。正常植物中多个ICK基因功能上的冗余性，可以确保每个胚珠中只形成一个功能大孢子和一个雌配子体以及随后胚的正常发育。

目录

声明

摘要

缩写词表(Abbreviations)

1 前言

1．1 细胞周期调控的关键节点

1．2 细胞周期调控因子及其功能

1．2．1 细胞周期依赖性蛋白激酶

1．2．2 细胞周期蛋白

1．2．3 细胞周期依赖性蛋白激酶抑制因子

1．2．4 Rb／E2F

1．3 植物有性生殖及发育过程

1．3．1 大孢子的形成

1．3．2 雌配子体的形成与胚囊发育

1．3．3 雄配子体的形成

1．3．4 植物受精与胚的形成

1．4 细胞周期与大孢子和雌配子体的形成

1．5 本研究目的及意义

2 材料与方法

2．1 试验材料

2．2 相关试剂

2．2．1 工具酶

2．2．3 生物生化试剂

2．2．3 主要试剂盒

2．3 主要试剂的配制

2．3．1 DNA提取液

2．3．2 PCR相关试剂

2．3．3 FAA固定液

2．3．4 Gus染色液

2．3．5 透明剂

2．4 试验方法

2．4．1 拟南芥种植

2．4．2 拟南芥种子灭菌

2．4．3 T-DNA插入突变体鉴定

2．4．4 总RNA的提取方法

2．4．5 RNA的浓度测定

2．4．6 反转录

2．4．7 表达分析

2．4．8 ICK六突变体和七突变体的构建

2．4．9 样品的固定

2．4．10 GUS染色

2．4．12 表达载体建构

2．4．13 拟南芥的转化

2．4．15 转基因植株的筛选及鉴定

2．4．16 互补检验

3 结果

3．1 ICK基因多突变体构建

3．1．1 ick3和ick4单突变体基因型检测及表达分析

3．1．2 ICK七突变体的基因型检测和表达分析

3．2 ICK七突变体主要形态表型分析

3．2．1 苗期相关表型分析

3．2．2 七突变体粒重增加

3．2．3 七突变体单株产量降低

3．3 ICK七突变体抽苔时间与野生型相似

3．4 ICK七突变体对非生物胁迫的反应

3．4．1 胁迫处理对七突变体根生长表现的影响

3．4．2 胁迫处理条件下七突变体生物量表现

3．5 ICK七突变体角果变短、胚珠败育

3．6 正反交实验证明胚珠败育与雌配子发育异常有关

3．7 ICK突变体花粉发育部分异常

3．8 ICK七突变体胚珠发育

3．8．1 七突变体的雌配子体数目增多

3．8．2 七突变体的非功能大孢子退化异常

3．8．3 七突变体中双胚与不同类型胚乳的形成

3．9 ICK七突变体可产生双胚苗

3．10 互补实验

3．10．1 利用ICK4互补七突变体的表型

3．10．2 利用ICK7互补七突变体的表型

4 讨论

4．2 细胞周期调控因子ICK与植物形态建成

4．3 细胞分裂调控与功能大孢子和胚囊的发育

4．4 ICK基因的下调表达与双胚和双胚乳的发育

4．5 ICK基因在进化上的意义

5 小结与展望

5．1 本研究的创新之处

5．2 展望

参考文献

附录

致谢