SlZF3调控开花时间和FolB2调控植物根发育的机理研究

摘要

番茄（Solanum lycopersicum）是全球最重要的蔬菜之一，在我国蔬菜产业中同样重要。在基础研究方面，番茄和拟南芥均是重要的模式植物。利用番茄和拟南芥研究植物开花以及根的发育调控机制能帮助我们深入认识植物的发育，同时为农作物的遗传改良提供重要的理论基础。
　　在本研究前期工作中发现，超表达番茄C2H2型锌指蛋白SlZF3可以提高植物的耐盐性，该锌指蛋白C端含有EAR-motif,具有转录抑制活性。同时，我们还观察到SlZF3超表达番茄和拟南芥在发育方面也发生了明显的变化，如矮化、叶片与茎秆之间夹角变小、开花延迟等。在本研究中，我们针对SlZF3调控开花时间的分子机制进行了较为深入的研究。此外，我们将SlZF3异位超表达到拟南芥的研究中发现了一个短根突变体folb2，通过研究发现该突变体非T-DNA插入导致，而是自然突变。通过图位克隆发现，突变体中AtFolB2的启动子和5'UTR区缺失了61bp，造成AtFolB2转录水平显著下降，并导致根的发育缺陷。AtFolB2编码二氢新碟呤醛缩酶，位于叶酸合成途径上游。在本研究中，我们较为深入的研究了AtFolB2如何调控植物主根和不定根的发育。主要研究结果如下:
　　1.在番茄和拟南芥中超表达SlZF3可以显著延迟开花时间，而RNA干涉SlZF3能够使番茄提早开花。同时，在拟南芥中超表达SlZF3的直系同源基因ZAT12也可以显著延迟开花时间，而RNA干涉ZAT12能够显著促进拟南芥开花。
　　2.通过酵母双杂交和荧光素酶报告系统分析发现SlZF3与AtCO直接互作。Co-IP实验表明SlZF3与AtCO在番茄中的同源蛋白SlCO1直接互作，并且其EAR-motif对互作不是必须的。另外，遗传学证据也证明SlZF3与AtCO是互作的。
　　3.双荧光素酶实验表明，SlZF3可显著抑制AtFT启动子的活性，而AtCO则可显著提高AtFT启动子活性。ChIP-qPCR实验表明，SlZF3或ZAT12可以结合在AtFT启动子靠近5'UTR的区域。通过EMSA实验进一步发现，SlZF3和ZAT12可以分别结合到SFT和AtFT启动子上的5'UTR Py-rich stretch和TCA顺式元件，但和单独一个顺式元件5'UTR Py-rich stretch或者TCA都不能结合。上述两个元件与AtCO蛋白在拟南芥AtFT启动子上的结合元件CORE2相邻，与番茄SFT启动子上的CORE2顺式元件距离76bp。
　　4.综合结果表明，SlZF3通过直接与CO互作以及结合到FT启动子上的两个顺式元件5'UTR Py-rich stretch和TCA而负调控植物开花。
　　5.在ZF3异位表达的拟南芥株系中偶然发现的一个根系突变体folb2，该突变体主根生长受抑制，在茎基处产生1-2个不定根。PI以及I2-IK染色发现folb2突变体根尖分生区不完整。图位克隆发现AtFolB2启动子和5'UTR过渡区缺失了61bp，该缺失造成AtFolB2转录水平显著下降。创建了folb2的功能互补材料(FC)和野生型背景的RNAi材料，发现互补材料中根系表型得到恢复，而RNAi材料的根系表型与folb2类似。同时也创建了AtFolB2在番茄中的同源基因SlFolB2的RNAi材料，其根系表型与folb2类似。
　　6.LC-MS测定叶酸发现，四氢叶酸THF及其衍生物5-M-THF或者四氢叶酸前体DHF，在folb2突变体和RNAi材料中显著下降，而在互补系中含量恢复至野生型水平。在培养基中外源施加5-F-THF可以恢复folb2突变体的表型。在番茄SlFolB2RNAi株系中，四氢叶酸THF及其衍生物（5-M-THF和5-F-THF）或者四氢叶酸前体DHF均显著下降。
　　7.探讨了AtFolB2突变对生长素分布和信号响应途径的影响。转录组分析发现，生长素运输和信号响应基因显著下调，而生长素响应下游基因LBD41显著上调表达，qRT-PCR进一步验证了该结果。LC-MS测定Col-0、folb2和FC中叶片和根中生长素含量发现，尽管突变体folb2中的生长素含量降低了，但是功能互补系中的生长素水平和folb2相比无显著差异，因此生长素含量的变化不是folb2突变体表型缺陷的主要原因。利用报告系DR5∶mGFP、PINs∶GFP、WOX5∶GFP以及DII∶VENUS∶YFP进行杂交调查报告基因表达，结果表明叶酸可以调控生长素向根尖极性运输以及生长素在根成熟区维管束和周围组织中的分布。
　　8.遗传学证据表明，LBD41是AtFolB2的一个下游靶基因。在folb2突变体中干涉LBD41后，folb2突变体根缺陷表型恢复至野生型状态。综合研究表明，叶酸通过调控生长素的极性运输以及分布对根尖分生区的保持起着关键作用。它主要通过LBD41调控植物主根和不定根的发育。

目录

声明

摘要

缩略词表

第一章 SlZF3调控开花时间的机理研究

1．课题的提出和研究背景

2 文献综述

2．1 植物开花的主要调控途径

2．2 光质对植物开花时间的调控

2．3 FT的结构、功能及其作用模式

2．4 FT的转录调控

2．5 CO的转录调控和转录后调控

2．6 锌指蛋白与植物开花

3 本研究的目的和意义

4 材料与方法

4．1 植物材料与生长条件

4．2 载体构建以及转基因材料创建

4．3 GUS染色

4．4 亚细胞定位

4．5 转录组分析

4．6 酵母双杂交分析

4．7 荧光素酶瞬时表达分析

4．8 免疫共沉淀和蛋白印迹分析

4．9 凝胶迁移实验(EMSA)

4．10 双荧光酶活性测定

5 结果

5．1 SlZF3是开花时间的负调控因子

5．2 SlZF3的表达受光周期影响

5．3 SlZF3／ZAT12与SlCO1／AtCO直接互作

5．4 EAR的作用及SlZF3与CO的遗传互作

5．5 SFT／AtFT是SlZF3／ZAT12下游靶基因

6 讨论

6．1 SlZF3／ZAT12是开花负调控因子

6．2 SlZF3／ZAT12可以抑制SlCO1／AtCO结合SFT／AtFT的活性

6．3 EAR结构域在SlZF3／ZAT12调控开花中的作用

第二章 Folb2调控植物根发育的机理研究

1 课题的提出以及研究背景

2 文献综述

2．1 植物根系的多样性

2．2 植物主根的发育

2．3 侧根和不定根的发育

2．4 叶酸

2．5 LBD家族调控植物根的发育

3 本课题的目的和意义

4 实验材料和方法

4．1 实验材料及培养条件

4．3 相关载体构建及转基因材料创建

4．4 RNA提取以及荧光定量PCR

4．5 转录组分析

4．6 进化树分析

4．7 细胞生物学研究方法

4．8 原生质体制备以及亚细胞定位

4．9 GUS报告系统载体构建及化学组织染色

4．10 生长素含量测定

4．11 叶酸提取和测定

5 结果

5．1 AtFolb2突变导致主根生长受抑制、不定根产生

5．2 AtFolB2／SlFolB基因特点分析

5．3 二氢新碟呤醛缩酶(DHNA)参与叶酸的合成

5．4 外源5-F-THF可恢复folb2表型

5．5 AtFolb2影响生长素的运输和分布

5．6 RNA干涉LBD41能恢复folb2突变体根缺陷表型

6 讨论

6．1 叶酸在根尖分生区(RAM)维持中的作用

6．2 叶酸参与调控生长素在根中的运输和分布

6．3 LBD41调控拟南芥主根和不定根的发育

7 结论和展望

参考文献

附录

作者简介

致谢