声明
摘要
缩略语表
1前言
1．1结核病及治疗策略
1．1．1结核病治疗策略
1．1．2联合用药的重要性
1．2抗结核药物杀菌及分枝杆菌耐药机制
1．2．1抗结核药物杀菌机制
1．2．2结核分枝杆菌耐药菌株的产生
1．2．3结核分枝杆菌耐药机制
1．3基因表达调控与分枝杆菌耐药性的关系
1．3．1基因表达调控及其分类
1．3．2基因表达调控对分枝杆菌耐药性产生的贡献
1．4 TetR／AcrR家族转录因子
1．4．1 TetR／AcrR家族转录因子结构
1．4．2 TetR／AcrR家族转录因子调控机制
1．4．3 TetR／AcrR家族转录因子生理功能
1．5转录因子作为新型药物靶标的前景
1．6本研究目的、意义和思路
2材料与方法
2．1材料
2．1．1供试菌株
2．1．2供试质粒
2．1．3抗生素
2．1．4酶和试剂盒
2．1．5培养基
2．1．6缓冲液及试剂配制
2．2实验方法
2．2．1 EtbR和InhA相关基因的引物设计和PCR扩增反应
2．2．2蛋白质表达纯化
2．2．3染色质免疫共沉淀(ChIP)
2．2．4凝胶迁移阻滞实验(EMSA)
2．2．5 DNA足迹实验(DNase I Footprinting)
2．2．6表面等离子共振(SPR)
2．2．7等温滴定量热实验(ITC)
2．2．8RNA抽提及实时定量PCR(qRT-PCR)
2．2．9 β-半乳糖甘酶活性分析
2．2．10分枝杆菌的基因敲除实验
2．2．11最小抑菌浓度测定(MIC)
2．2．12分枝杆菌生长曲线的测定
2．2．13药物胁迫下胞内结核分枝杆菌生存率分析
3结果与分析
3．1非致死浓度的乙胺丁醇增加分枝杆菌的异烟肼敏感性
3．1．1 EtbR影响分枝杆菌的异烟肼敏感性
3．1．2 EtbR是一个TetR／AcrR家族转录因子
3．1．3 EtbR在分枝杆菌中高度保守
3．2 EtbR识别其自身及inhA基因上游一个20 bp的保守结合位点
3．2．1 EtbR蛋白质的纯化
3．2．2 EtbR在体外特异性结合自身启动子和inhA基因上游的调控序列
3．2．3 EtbR在细菌细胞内结合自身启动子和inhA基因上游的调控序列
3．2．4 EMSA截短实验鉴定EtbR的结合区域
3．2．5 DNA足迹法鉴定EtbR识别一个20 bp的保守结合位点
3．3 EtbR是一个转录抑制子，负调控inhA基因的表达
3．3．1 EtbR超表达菌株和敲除菌株的构建
3．3．2实时定量PCR检测EtbR负调控inhA基因的表达
3．3．3 β-半乳糖甘酶活性实验检测EtbR负调控inhA基因的表达
3．4 EtbR能特异性结合乙胺丁醇
3．4．1 ITC(等温量热滴定法)证实EtbR与乙胺丁醇存在相互作用
3．4．2 SPR(表面等离子共振)证实EtbR与乙胺丁醇存在相互作用
3．5 EMB能促进EtbR的DNA结合活性
3．5．1 EMSA实验证明EMB促进EtbR的DNA结合活性
3．5．2 SPR实验证明EMB促进EtbR的DNA结合活性
3．5．3定量分析EMB促进EtbR的DNA结合活性
3．6．1 β-半乳糖甘酶活性实验验证EMB促进EtbR的转录抑制活性
3．6．2 qRT-PCR检测EMB胁迫下BCG中inhA基因的表达水平
3．7 EtbR增强分枝杆菌中乙胺丁醇介导的异烟肼敏感性
3．7．2 EtbRMtb增强BCG中乙胺丁醇介导的异烟肼敏感性
3．7．3 EtbRMsm增强耻垢分枝杆菌对异烟肼的敏感性
3．7．4 EtbRMsm增强耻垢分枝杆菌中乙胺丁醇介导的异烟肼敏感性
3．8超表达EtbR使药物胁迫下分枝杆菌在小鼠巨噬细胞中的存活率降低
4总结与讨论
4．1总结
4．2讨论
4．2．1 EtbR介导的乙胺丁醇和异烟肼联合使用机制
4．2．2 EtbR是一个新型的转录抑制子，结合EMB负调控inhA基因的表达
4．3展望
参考文献
论文发表情况
致谢
