大规模细胞培养生产紫杉醇工艺研究

摘要

因为紫杉醇在培养液中的溶解度很低,其最大溶解度仅为20mg/L左右;而且紫杉醇在细胞内积累会影响植物细胞活性,引起细胞形态显著改变.因此在这些培养技术中,双液相红豆杉细胞培养生产紫杉醇具有潜在的应用价值,采用双液相培养,可以减少紫杉醇在胞内对于细胞代谢产物的反馈抑制作用和保护紫杉醇免受酶的分解,从而促使更多的紫杉醇合成并释放到胞外被有机溶剂萃取.因此该文着重研究了即能刺激紫杉醇的胞内合成,又能刺激紫杉醇的胞外释放的途径.结合摇瓶培养,用双液相培养与其他培养技术相结合,实现了细胞在小规模反应器中的培养放大.该论文的主要研究成果见下:1.研究了三种有机溶剂(hexadecane, decanol and dibutylphthalate,5-20﹪,v/v)对中国红豆杉细胞株系在双相培养中细胞的生长与紫杉醇合成的影响.2.利用紫杉醇的内生真菌制备的诱导子来刺激紫杉醇的生物合成.3.稀土化合物曾被广泛应用于农业生产的研究,但是对于植物次生代谢的合成却未得到重视.该文首次将其作为一种诱导子概念提出,并研究了其对紫杉醇的合成及释放的作用.重点研究了其在生物合成紫杉醇的培养工艺中的作用.4.利用DMSO和表面活性剂Tween—80、部分无机盐、甘露醇或山梨醇渗透压冲击,确定了刺激紫杉醇释放与合成的方式.5.比较了中国红豆杉细胞在用棉花塞或铝铂纸密封的不同培养体积的摇瓶中细胞生长与合紫杉醇的合成培养,并对悬浮细胞在知治的搅拌式反应器河内循环气升式反应器进行了10L规模的放大培养.6.综合诱导子、紫杉醇合成的生物前体、旁路抑制剂、紫杉醇释放刺激等因子,通过正交试验研究了确定了提高紫杉醇生物合成代谢的调节方法,并提出了用于实现两段法细胞培养生产紫杉醇的生产培养基.7.将生产培养基、紫杉醇诱导释放及两相培养技术相结合,设计了能够实现半连续培养的反应器放大培养工艺.

目录

文摘

英文文摘

1章大规模植物细胞培养的进展

1.1植物细胞培养生产有用次生代谢物研究的进展

1.2植物细胞培养生产抗癌药物—紫杉醇

1.3植物细胞内产物释放研究进展

2章红豆杉细胞株的建立

3章中国红豆杉细胞培养两相培养生产紫杉醇工艺优化研究

3.1材料与方法

3.2结果分析

3.3结论

3.4总结

4章真菌诱导子结合培养基更新实现紫杉醇生产工艺优化

4.1材料及方法

4.2结果与讨论

4.3讨论

4.4总结

5章稀土元素对红豆杉细胞的诱导作用研究

5.1稀土化合物对中国红豆杉悬浮培养细胞紫杉醇生产和释放的影响

5.2镧对三种红豆杉细胞悬浮细胞的生长及紫杉醇合成释放的影响

5.3硫酸铈铵(RE1)和有机相的协同作用

5.4总结

6章细胞通透性及超声波对紫杉醇释放的研究

6.1无机盐及多元醇的渗透压冲刺及紫杉醇释放研究

6.2 Tween-80渗透处理红豆杉细胞

6.3超声波对红豆杉悬浮细胞生长及紫杉醇释放的研究

6.4超声波对红豆杉悬浮细胞生产紫杉醇的诱导机理研究

6.5总结

7章诱导子及其它调节剂对紫杉醇生物合成的代谢调节

7.1前体及非生物诱导子添加对细胞紫杉醇合成的影响

7.2前体单因子试验

7.3正交试验分析诱导子、前体、抑制剂等各类代谢调控因子协同作用

7.4生产培养基

8章细胞培养从摇瓶培养到反应器放大的研究

8.1材料与方法

8.2结果与讨论

8.3绪论结论

8.4总结

9章两相培养在反应器放大培养生产紫杉醇中的应用研究

9.1材料与方法

9.2两相培养技术在鼓泡式反应器中的培养模式

9.3两相培养结合两段法调整放大培养

9.4无固定相的培养体系结合两相培养技术在紫杉醇合成放大中的优化

9.5总结

9.6反应器培养细胞中紫杉烷类物质的鉴定

10章植物细胞培养生产紫杉醇存在的主要技术问题

10.1遗传因素的影响

10.2细胞状态对合成紫杉醇的影响

10.3次生代谢的定量调控

10.4红豆杉细胞培养放大过程中存在的问题

参考文献

在读期间正式接受和已发表的论文

致谢