凝血酶的神经细胞毒性作用及凝血酶预处理保护作用的实验研究

摘要

第一部分:海马神经元的原代培养及凝血酶作用后PAR-1mRNA表达的研究。目的：探讨海马神经元的原代培养技术及凝血酶(Thrombin，TM)对海马神经元蛋白酶激活受体-1(Proteaseactivatedreceptor-1，PAR-1)mRNA表达的影响。方法：取新生大鼠海马区，应用组织消化法，加B27添加剂培养海马神经元，观察神经元的形态，采用神经元特异性烯醇化酶(Neuron-specificEnolase，NSE)细胞免疫化学方法鉴定神经元的纯度。在不同浓度的TM作用海马神经元不同时间点，应用噻唑蓝(MTT)方法检测海马神经元的存活率，应用逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术检测PARmRNA的表达。结果：原代培养的海马神经元生长旺盛，经NSE鉴定神经元纯度在90％以上。不同浓度的TM作用后，海马神经元的存活率呈剂量依赖性降低，40U/mlTM组最低；TM作用后不同时间点海马神经元的存活率呈时间依赖性降低，72h组最低(p＜0.01)。原代培养海马神经元上表达三种PAR受体，即PAR1mRNA、PAR2mRNA、PAR3mRNA。1U/mlTM组海马神经元PAR-1mRNA表达增加，与对照组比较差异具有显著性(p＜0.01)，随TM浓度的增加PAR-1mRNA表达逐渐增加，在40U/mlTM组达高峰(p＜0.01)。TRAP组海马神经元PAR-1mRNA表达增加，与对照组比较差异具有显著性(p＜0.01)。TM作用后6hPAR-1mRNA表达开始增加，与对照组比较差异具有显著性(p＜0.05)，随TM作用时间的延长而表达增强，24h时达高峰(p＜0.01)，72h维持高表达(p＜0.01)。结论：海马神经元原代培养纯度高符合实验要求。海马神经元表达三种PARmRNA。TM对海马神经元有毒性作用，与剂量及时间呈依赖关系。TM可能是通过上调及激活PAR-1受体而发挥细胞毒性作用。 第二部分:凝血酶诱导大鼠海马神经元凋亡的研究。目的：探讨不同浓度凝血酶(TM)对海马神经元凋亡的影响及其可能机制。方法：将原代培养海马神经元分为对照组、不同浓度TM(1U/ml、10U/ml、20U/ml及40U/ml)组及凝血酶受体激活肽(TRAP)组。在倒置显微镜下观察海马神经元形态的变化，用TUNEL法及流式细胞术检测海马神经元凋亡细胞数及凋亡百分率。结果：1U/mlTM组海马神经元的形态与对照组比较无明显变化。随着TM浓度增加，神经元发生明显的突起回缩，细胞间的极性消失并聚集成团，部分细胞核浓缩，染色质边集。剂量越大，改变越早越严重。1U/mlTM组TUNEL阳性细胞数和凋亡百分率与对照组比较差异无显著性(p＞0.05)，随着TM浓度增加，TUNEL阳性细胞数和凋亡百分率呈剂量依赖性增加，与对照组比较差异有显著性(p＜0.01)。TRAP可导致细胞形态发生变化，作用与大剂量TM相似。TRAP组TUNEL阳性细胞数和凋亡百分率与40U/mlTM组比较差异无显著性(p＞0.05)。结论：TM可诱导海马神经元凋亡，凋亡呈剂量依赖性。TM可能是通过激活蛋白酶激活受体-1(PAR-1)介导海马神经元凋亡。第三部分凋亡调控因子在凝血酶诱导海马神经元凋亡中的作用。目的：探讨凋亡调控因子Bcl-2、Bax、JNK及Caspase-3在凝血酶(TM)诱导海马神经元凋亡中的动态变化，阐明TM诱导凋亡的机制。方法：海马神经元经40U/mlTM作用0h、6h、12h、24h、48h、72h后终止培养，应用免疫细胞化学检测Bcl-2及Bax蛋白表达，免疫印迹技术(WesternBlot)检测P-JNK、JNK及Caspase-3蛋白表达。结果：TM作用6h后，Bcl-2蛋白表达增加，与0h组相比差异有显著性(p＜0.01)，12h后开始下降，随TM作用时间的延长，Bcl-2蛋白表达水平逐渐下降，到48h达到最低值，72h后Bcl-2蛋白表达开始回升。TM作用6h后，Bax蛋白表达增加，随作用时间的延长，Bax蛋白表达水平逐渐上升，到48h达到最高值(p＜0.01)。Bcl-2/Bax比值逐渐降低，在48h小时达最低。TM作用0h时P-JNK蛋白无表达，6h后开始表达，与0h组比较差异存在显著性(p＜0.01)。P-JNK表达12h时达高峰(p＜0.01)，并持续到24h，48h后逐渐降低。0h组可见有少量JNK蛋白表达，6h后JNK表达增加(p＜0.01)，随凝血酶作用时间的延长，JNK表达无明显变化。TM作用6h后Caspase-3蛋白无明显表达，12h后Caspase-3蛋白表达开始增加，与0h组相比差异有显著性(p＜0.01)，随TM作用时间的延长，Caspase-3蛋白表达水平逐渐上升，到48h达到最高值(p＜0.01)，72h表达开始降低。结论：TM可能是通过抑制Bcl-2的表达，增强Bax的表达，降低Bcl-2和Bax的比值，进而激活JNK信号传导机制，最终激活Caspase-3导致海马神经元凋亡。 第四部分:凝血酶对海马神经元游离钙离子的影响及其机制。目的：研究凝血酶(TM)对海马神经元内游离钙离子水平的影响及其机制。方法：将原代培养海马神经元分为对照组、不同浓度TM(1U/ml、10U/ml、20U/ml、40U/ml)组、凝血酶受体激活肽(TRAP)组。MK-801和尼莫地平预处理后加入40U/mlTM。采用钙离子指示剂Fura-2荧光双波长法检测海马神经元内游离钙离子的浓度。结果：TM可使海马神经元内游离[Ca2+]i显著升高(p＜0.01)，且呈剂量依赖性。TRAP可明显升高细胞内游离[Ca2+]i。当胞外Ca2+为1.3mmol/L时，40U/mlTM可使海马神经元游离[Ca2+]i明显增加(p＜0.01)；而当胞外Ca2+为0.0mmol/L时，40U/mlTM不影响海马神经元游离[Ca2+]i。预先加入MK-801可显著降低TM的升钙作用，而预先加入尼莫地平不能抑制TM的升钙作用。结论：TM使神经细胞内游离Ca2+浓度异常升高的作用机制可能是通过激活凝血酶受体-1(PAR-1)，继而激活NMDA受体门控的Ca2+通道介导胞外Ca2+大量内流。 第五部分:凝血酶预处理对海马神经元的保护作用及其机制的研究。目的：研究凝血酶预处理(ThrombinPreconditioning，TPC)对大剂量凝血酶(TM)诱导海马神经元凋亡的影响，阐明TPC的保护作用。方法：海马神经元分别经生理盐水(Sham组)、小剂量TM(TPC组)及凝血酶受体激活肽(TRAP组)预处理48h后再加大剂量TM作用24h。采用MTT法、TUNEL法及流式细胞术检测海马神经元存活率、凋亡细胞数和凋亡百分率，应用免疫细胞化学及免疫印迹方法检测神经元Bcl-2、Bax及Caspase-3蛋白表达。结果：与Sham组比较，TPC组海马神经元的存活率明显增高(p＜0.01)，TUNEL阳性细胞数和凋亡百分率明显降低(p＜0.01)，Bcl-2表达上调，Bax及Caspase-3表达明显下调(p＜0.01)。与Sham组比较，TRAP预处理组海马神经元的存活率增高(p＜0.01)，TUNEL阳性细胞数和凋亡百分率明显降低(p＜0.01)，Bcl-2表达上调，Bax及Caspase-3表达明显下调(p＜0.01)。TRAP预处理组与TPC组相比差异无显著性(p＞0.05)。结论：TPC可抑制TM导致的神经细胞凋亡起保护作用。激活PAR-1，促进Bcl-2的表达和降低Bax的表达，减少Caspase-3的活化，可能是TPC抑制细胞凋亡的机制之一。

目录

论文说明：资助

前言

第一部分海马神经元的培养及凝血酶作用后PAR-1 mRNA表达的研究

实验一：海马神经元的原代培养及鉴定

材料

方法

结果

讨论

参考文献

实验二：凝血酶对海马神经元PAR-1 mRNA表达的影响

材料

方法

结果

讨论

参考文献

第二部分凝血酶诱导大鼠海马神经元凋亡的研究

材料

方法

结果

讨论

参考文献

附图

第三部分凋亡控制因子在凝血酶诱导海马神经元凋亡中的作用

材料

方法

结果

讨论

参考文献

附图

第四部分凝血酶对海马神经元游离钙离子的影响及其机制

材料

方法

结果

讨论

参考文献

第五部分凝血酶预处理对海马神经元的保护作用及其机制的研究

材料

方法

结果

讨论

参考文献

附图

结论

综述一凝血酶受体与中枢神经系统的研究进展

综述二凝血酶在中枢神经系统中的双重作用

英文缩略词表

博士期间发表论文

致谢