CD151促细胞迁移、血管形成及大鼠缺血后肢血运重建

摘要

研究背景和目的：虽然近年来外科治疗和介入治疗均取得了很大进展，但仍然不能彻底解决肢端缺血和心肌缺血性疾病治疗中的诸多问题，包括介入治疗后血管再狭窄、旁路移植血管再闭塞以及上述疾病发展致终末小血管弥漫性病变等。通过给予外源性促血管生成因子的重组蛋白或转染特异性基因，促进缺血组织的血管新生、侧支循环建立、改善缺血以及促进器官功能恢复是近年来研究的新动向。转导促血管生长信号的细胞膜分子分为两大类，分别为生长因子受体(growthfactorreceptors)和整合素(integrins)。目前治疗性血管生成涉及的靶点主要集中在生长因子受体这一类，但最近的临床研究结果并不令人乐观。对大动脉阻塞性疾病而言，只有在非缺血区的供血动脉与阻塞处以下的动脉系统之间建立低阻力性连接，即建立侧支循环，才是有效的代偿。因此有必要探索更多的促血管生成基因，明确血管生成这一复杂过程中的各个重要成员的作用，合理联合应用多种促血管生成基因才能达到满意的治疗效果。 CD151是一种具有四跨膜结构的膜蛋白，能与多种整合素亚型结合形成整合素-CD151复合体，是整合素信号转导的跨膜连接器，其在细胞黏附、迁移以及体外血管形成中均发挥着重要的作用。在缺血性疾病中增强CD151的表达，能否促进缺血组织的血管生成，进而达到改善血运重建及恢复缺血组织器官功能的效果目前尚未可知。本研究旨在通过体内外实验证实，提高CD151基因的表达，能够促进细胞迁移、体外血管形成以及增强缺血组织血管生成和血运重建。 研究方法：首先通过PCR方法将CD151基因末端连接HA尾(HAtag)，通过更换引物的酶切位点将其分别呈正向和反向克隆到双链腺相关病毒表达载体上(dsAAV)。将其与重组腺相关病毒包装质粒pXX2和辅助质粒pXX6按摩尔比1：1：1的比例，通过磷酸钙沉淀法共转染293细胞，包装制备rAAV-CD151-HA和rAAV-antiCD151，用斑点杂交法测定病毒的滴度。将获得的病毒转染Tca8113细胞，经Westernblot检测CD151蛋白质的表达时间梯度，观察转染rAAV-CD151-HA和rAAV-antiCD151后CD151蛋白质表达的变化，同时确定最佳的表达时间。 然后将构建的含有正义和反义CD151基因的重组腺相关病毒分别转染舌鳞癌细胞Tca8113和内皮细胞株ECV304。通过Boyden小室培养和划痕修复实验观察CD151的表达对这两种细胞的定向迁移和非定向迁移能力的影响。将转染后的ECV304细胞种植在Matrigel上，观察其条索状微血管结构的形成情况。 最后将Wistar大鼠共12只，随机分为实验组和对照组，每组各6只。实验组大鼠右侧后肢肌肉注射局部转染rAAV-CD151，对照组大鼠注射rAAV-GFP(1×1010p.f.u/只)。基因转染2周后行股动脉切除术建立右侧大鼠后肢缺血模型。通过大鼠损伤评分、后肢皮肤温度测定、后肢动脉造影和缺血肌肉组织毛细血管密度检测，观察缺血肢体血管再生和评价血运重建情况。用RT-PCR、Westernblot和免疫组化方法检测两组大鼠局部缺血肢体CD151的表达。 实验结果：成功包装了携带有目的基因的重组腺相关病毒rAAV-CD151-HA和rAAV-antiCD151，并获得了足够实现生理表达量的病毒滴度(2×1011p.f.u./ml和1×1011p.f.u./ml)。 将rAAV-CD151-HA和rAAV-antiCD151分别转染Tca8113细胞和ECV304细胞，通过Boydan小室培养和划痕修复试验证实rAAV-CD151-HA能够增强这两种细胞的表达，而转染rAAV-antiCD151抑制细胞CD151的表达后，这两种细胞的迁移能力均显著下降。此外高表达CD151的ECV304细胞在Matrigel形成条索状结构，并相互连接形成毛细血管网络。而转染rAAV-antiCD151阻断CD151表达后ECV304细胞聚集成团状。这表明CD151能够有效地促进细胞迁移和体外血管形成。 rAAV-CD151-HA经肌肉注射转染大鼠后肢缺血模型后，能有效促进转染局部肌肉组织CD151的表达，且未见异位表达。转染rAAV-CD151-HA的实验组大鼠缺血后肢功能恢复优于对照组；局部皮肤温度较对照组高1.7℃(P＜0.05)，与对侧正常肢体皮肤温度差异无显著意义；后肢血管造影结果显示实验组缺血侧血管评分明显高于对照组，分别为2.56±0.37和1.57±0.39；实验组缺血后肢肌肉组织毛细血管密度也明显较对照组高，分别为(609±83.89)/mm2和(507±70.65)/mm2，两组比较均有显著性差异(P＜0.05)。 实验结论：经本研究证实：①rAAV-CD151-HA能增强体外培养细胞CD151的表达，有效促进细胞迁移和体外血管形成； ②rAAV-antiCD151能明显阻断体外培养细胞CD151表达，抑制细胞的迁移和体外血管的形成； ③腺相关病毒介导的CD151基因能够在机体内稳定而有效的表达； ④rAAV-CD151能够显著提高局部缺血组织的血管再生能力，促进缺血肢体功能的恢复。CD151将成为血管再生治疗的新的备选基因。这一研究结果有利于将各种促血管生成因子合理联用，使生物治疗更加合理有效。

目录

研究背景

第一部分rAAV-CD151-HA和rAAV-antiCD151的包装及其在细胞内的表达

实验材料

实验方法

实验结果

1.重组包装质粒dsAAV-CD151与dsAAV-antiCD151的构建与鉴定

2.重组腺相关病毒的包装

3.转染前后细胞CD151蛋白的表达

讨论

参考文献

第二部分CD151促细胞迁移和体外血管形成作用的研究

实验材料

实验方法

结果

1.CD151对细胞迁移的影响

2.CD151对细胞定向迁移的影响

3.CD151对体外血管形成的影响

讨论

参考文献

第三部分CD151基因促大鼠缺血后肢血管再生和血运重建的实验研究

实验材料

实验方法

结果

1.红四氮唑染色检测大鼠后肢缺血模型

2.RT-PCR检测大鼠外源性CD151mRNA的表达

3.大鼠缺血后肢CD151蛋白质的表达

4.大鼠缺血后肢功能评价

5.后肢皮肤温度

6.后肢动脉造影响

7.缺血后肢平均毛细血管密度

讨论

参考文献

小结

缩略词表

治疗性血管生成的研究进展

附录:撰写论文

致谢