哮喘血清被动致敏人气道平滑肌Kv变化及其细胞内信号调控机制的研究

摘要

研究背景：哮喘是一种慢性气道炎症性疾病，气道反应性增高是其特征性表现。近年对支气管哮喘的研究多集中在炎症介质介导的气道炎症本身，而对于气道炎症结果产生的气道高反应性(AHR)的发生机制尚未完全阐述清楚。对炎症结果的重要效应器——气道平滑肌细胞(ASMCs)上张力、收缩反应性及电活动、兴奋性的改变尚需进一步研究。 平滑肌细胞的电活动主要是由其膜上的钾电导所决定的。在哮喘状态下，ASMCs兴奋性增高，表现出对导致支气管收缩物质的高反应性。气道平滑肌上钾通道通过控制细胞上静息膜电位(Em)而成为肌张力形成的基础，可能在哮喘支气管痉挛时起重要作用。肌细胞兴奋收缩偶联依赖于其细胞膜的去极化和超极化，来调节电压依赖钙通道的开放，进而影响细胞内Ca2+浓度，结果都是通过影响细胞钙内流引起张力改变。平滑肌细胞膜上钾通道开放，K+外流增加，造成Em超极化，电压活化钙通道关闭，减低钙内流，进而产生舒张作用。相反的钾通道关闭，引起Em去极化，电压活化钙通道开放，增加胞质内钙浓度，进而产生收缩效应。人气道平滑肌细胞(HASMCs)上主要存在有电压依赖钾通道(Kv)、ATP敏感钾通道(KATP)和钙激活钾通道(KCA)三种钾通道，相对应的阻断剂分别为4-氨基吡啶(4-AP)、格列苯脲(Glib)和四乙铵(TEA)，这些钾选择性离子通道每一种都有其独特的基因家族，在不同的平滑肌组织中有选择性的表达。Kv有很高的电压敏感性能感受Em变化，膜去极化后导致其缓慢激活，产生延迟外向钾电流，使Em趋向于超极化方向，对Em恢复稳定和降低细胞兴奋性有重要生物学意义，通过通道的开放和关闭来控制动作电位波形和神经发放模式影响静息Em的产生。我们以往的动物试验-1-研究结果表明，Kv参与气道平滑肌张力的调控，哮喘大鼠气道平滑肌Kv电流活性较正常下调，致平滑肌兴奋性增高，从而可能参与哮喘AHR机制的形成。但有关哮喘HASMCs中Kv变化的研究尚未见报道。 蛋白激酶C(PKC)信号通道是重要的细胞内信号传导途径之一，它参与气道平滑肌多种功能调节作用，在哮喘发病的多个环节起重要的介导作用。PKC在平滑肌的收缩调节中有重要作用。试验研究发现，PKC通道对豚鼠气道不同部位的张力有不同的调节作用，致敏豚鼠气道PKC功能较正常增强。但它对HASMCs以及哮喘状态下的张力调节情况，尚需进一步研究。最近的研究发现，PKC活化可影响多种细胞的Kv通道活性，激活PKC能够抑制血管平滑肌Kv功能。在我们大鼠哮喘模型研究中发现，激活PKC可以抑制气道平滑肌的Kv的表达和通道活性，参与哮喘气道平滑肌过度收缩的发病过程。但PKC对HASMCsKv的活性是否有类似的影响也需进一步明了。蛋白激酶A(PKA)和蛋白激酶G(PKG)均是细胞信号传导的关键调节酶。两条信号通道在ASMCs对一些物质的舒缩反应和炎症介质的调节中发挥重要作用，可能参与哮喘的发病机制。他们对血管平滑肌等多种细胞上的钾通道均有调节作用，从而对细胞的收缩兴奋性产生影响。激活PKA或PKG可引起钾通道开放从而舒张血管平滑肌。但二者是否对HASMCs上Kv通道有调节作用，目前尚需进一步明了。 第一部分:Kv在正常与被动致敏人气道平滑肌张力调控中作用的相关电生理和基因亚型Kv1.5的研究 目的：研究Kv对正常与体外被动致敏HASMCs的张力调控作用及其分子机制，探讨其基因亚型Kv1.5在调节Kv活性中的作用。 方法：采用肌张力试验、逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、Westernblotting、全细胞膜片钳、免疫细胞化学、脂质体(LP)转染反义寡核苷酸(AsODN)等技术，以钾通道阻断剂为工具，对正常与哮喘患者血清致敏HASMCs张力、细胞Kv的mRNA和蛋白质表达进行研究；观察转染Kv1.5AsODN后Kv活性的改变。 结果：Kv阻断剂4-AP可引起正常HASMCs肌环产生浓度依赖性收缩反应，达到最大效应一半所需浓度的负对数值(pD2)为(2.09±0.09)，人哮喘血清致敏组为(2.44±0.16)，差异有显著性(p＜0.01)；但最大反应强度(Emax)分别为正常组(24.0±6.4)mg/mg，人哮喘血清致敏组(31.8±7.3)mg/mg，差异无显著性(p＞0.05)。在培养的HASMCs上，Kv1.2、Kv1.3和Kv1.5基因mRNA均有表达；人哮喘血清致敏的HASMCsKv1.5基因mRNA(p＜0.01)和蛋白质(p＜0.01)的表达均下降。用脂质体转染Kv1.5AsOND后，HASMCsKv1.5mRNA和蛋白质的表达均下降；Kv电流活性受到显著抑制；使细胞Em趋向于去极化方向。 结论：体外被动致敏HASMCsKv功能较正常下调，致平滑肌兴奋性增高，该变化可能主要与Kv1.5基因相关。 第二部分:被动致敏人气道平滑肌细胞Kv变化的细胞内信号调控机制研究 目的:研究哮喘患者血清被动致敏HASMCsKv的变化，探讨其PKC、PKA和PKG信号调控机制。 方法:采用全细胞膜片钳、RT-PCR、免疫细胞化学和Westernblotting技术，观察人哮喘血清被动致敏后的HASMCsKv活性和PKC-a及Kv1.5蛋白质表达的变化；采用肌张力和全细胞膜片钳试验，观察PKC对正常与哮喘患者血清被动致敏HASMCs张力、急性分离HASMCsKv活性和Em的影响，以及PKC、PKA和PKG对HASMCs的Kv活性和Kv1.5mRNA及蛋白质表达的影响。 结果:人哮喘血清致敏后的HASMCs的PKC-amRNA和蛋白质表达升高，Kv活性及其亚型Kv1.5mRNA和蛋白质的表达均下降；PKC激活剂豆蔻酰佛波醇乙酯(Phorbol12-myristate13-acetate，PMA)显著抑制HASMCs的Kv电流活性，降低Kv1.5亚型的表达，该效应可被PKC阻断剂-3-Ro31-8220显著逆转。PMA可引起正常HASMCs肌环产生浓度依赖性收缩反应，人哮喘血清致敏组产生的收缩反应与正常组比较明显增强，差异有显著性(p均＜0.05)，两组的该反应可被PKC阻断剂Ro31-8220和钙通道阻断剂硝苯地平(nifedipine)完全抑制。PMA可抑制急性分离正常HASMCs的Kv电流活性，使Em趋向于去极化，与PMA溶剂二甲基亚砜(DMSO)干预组比较，差异有显著性(p均＜0.01)，该效应可被PKC阻断剂Ro31-8220显著逆转(p均＜0.01)。PKA激活剂8-brom-cAMP显著增强HASMCs的Kv电流活性，促进Kv1.5亚型的表达，该效应可被PKA阻断剂Rp-cAMP显著逆转。PKG激活剂8-brom-cGMP显著增强HASMCs的Kv电流活性，促进Kv1.5亚型的表达。 结论:被动致敏的HASMCs的Kv活性降低，可能与PKC活化后的直接作用及进而下调Kv表达有关。激活PKA和PKG能够增强HASMCs的Kv功能，抑制细胞兴奋性。推测可能为PKA和PKG信号通道引起HASMCs舒张反应的作用机制之一。

目录

第一部分 Kv在正常与被动致敏人气道平滑肌张力调控中作用的相关电生理和基因亚型Kv1.5的研究

分题1 Kv在正常与被动致敏人气道平滑肌张力调控中的作用

前言

材料和方法

结果

讨论

参考文献

附图

分题2脂质体转染Kv1.5反义寡核苷酸对人气道平滑肌Kv活性的影响

前言

材料与方法

结果

讨论

参考文献

附图

第二部分 被动致敏人气道平滑肌细胞Kv变化的细胞内信号调控机制研究

分题1被动致敏人气道平滑肌细胞Kv变化及其PKC信号调控机制

前言

材料与方法

结果

讨论

参考文献

附图

分题2 PKC对正常与被动致敏人气道平滑肌张力及其对Kv活性的影响

前言

材料和方法

结果

讨论

参考文献

分题3 PKA和PKG信号通道对人气道平滑肌Kv活性及其亚型Kv1.5表达的影响

前言

材料和方法

结果

讨论

参考文献

附图

附彩图

综述 钾通道与支气管哮喘

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