二恶英的毒性与检测方法研究

摘要

一、用TSA或AzaC预处理增加TCDD诱导特殊细胞的P450基因表达的水平 目的:探讨四氯二苯并-p-二恶英TCDD在用去甲基化制剂5-氮杂-2'-脱氧胞苷(AzaC)预处理后对人体HepG2和A549及SPC-A1细胞中的P450基因表达的影响， 方法:用常规的细胞培养方法，细胞用100ng/ml曲古抑菌素A(TSA)预处理24h或用5μM的5-氮杂-2'-脱氧胞苷预处理96h，再用浓度为10nMTCDD染毒24h，用RT-PCR和免疫组化方法检测不同物质诱导细胞对CYP基因mRNA及其蛋白的表达水平。 结果:在HepG2细胞，TCDD强烈诱导CYP1A1，CYP1B1基因表达增强，而对CYP1A2基因表达呈低诱导(稍增大)，用AzaC对CYP1B1表达无影响。相对比，在A549细胞，TCDD强烈诱导CYP1A1，CYP1B1基因表达增强，但对CYP1A2基因无诱导表达。在A549细胞，用TSA和Azac预处理后增加TCDD对CYP1家族的诱导。然而，这种高诱导现在HepG2细胞中未能观察到。免疫组化方法检测CYP1A1蛋白的表达水平增加的。 结论:TCDD能诱导人肝和肺中CYP1A1的接触水平。AzaC，这种去DNA甲基化剂，增加CYP1A1,CYP1A2，和CYP1B1表达水平。而且不影响TCDD的诱导水平。用AzaC预处理后，CYP1A2表达增强，甚至没有TCDD暴露的情况下。且用AzaC预处理后AhR表达增强的仅在A549细胞和SPC-A1细胞。AhR和ARNTmRNA在这三种细胞中结构表达相似的，即使暴露在TCDD下也没有改变，在HepG2细胞中，用TSA(曲古抑菌素A，制滴菌素)和Azac处理细胞并不改变AhR和ARNT基因的表达水平。 二、TCDD对肝癌细胞生长抑制及DNA损伤基因的诱导 目的:TCDD属于多环芳香烃化合物，TCDD来源于工业废弃物的一种环境污染物。在人类，它是最具有潜在毒性和促癌物之一。能产生许多毒性，引起动物和人类致畸和致癌。一般来讲,DNA损伤剂诱导抑癌基因p53蛋白，导致细胞生长抑制或凋亡。HepG2细胞株广泛应用于研究TCDD在体外的影响的研究。因此，探讨四氯二苯并-P-二恶英(TCDD)对人体肝癌细胞株(HepG2)DNA损伤和损伤诱导基因的表达的影响。 方法:以噻唑蓝(MTT)法检测TCDD对细胞的毒作用，单细胞凝胶电泳检测DNA损伤情况，逆转录聚合酶反应(RT-PCR)检测基因表达水平。 结果:TCDD以(0.5-20nM)处理肝癌细胞株(HepG2)细胞24h，细胞生存力从94％降到69％。10nM的TCDD处理12h、24h，细胞生存力分别降到85％、71％，DNA损伤加重；TCDD染毒48h后，细胞生存力降至67％，DNA损伤最重。用10nM的TCDD染毒24h，GADD135基因表达相对上升，P38MAPK、P53、GADD34、GADD45四个基因在染毒期间表达下降。 结论:研究了TCDD对人体肝癌细胞株HepG2中GADD34，GADD45，GADD153基因和P53、P38MAPK基因表达的影响。结果表明TCDD能诱导DNA的损伤，细胞在修复受损DNA时伴随GADD基因表达水平的改变。二恶英对人体肝癌细胞株(HepG2)中P53基因和P38MAPK基因有诱导作用，在肺腺癌细胞株(SPC-A1)仅见对P38MAPK基因有诱导作用，P53蛋白未见阳性表达。DNA损伤直接或间接的影响有可能是评价TCDD引起致癌的危险的指示剂。 三、TCDD诱导癌细胞凋亡的研究 目的:研究二恶英诱导HepG2肝癌细胞、肺癌A549细胞、肺癌SPC-A1细胞三种细胞凋亡。TCDD诱导许多细胞产生凋亡已有报道，但TCDD对SPC-A1细胞在形态学上及在细胞再生没有报道。研究TCDD作用于SPC-A1细胞时是否引起凋亡。探讨TCDD对肺癌细胞系SPC-A1细胞形态和生长的影响。 方法:用TCDD对三种细胞染毒24h，再细胞爬片和HE染色，光学显微镜下观察并照相。利用体外培养细胞培养技术，将不同浓度的TCDD与肺癌细胞系SPC-A1共同培养，SPC-A1细胞株在37℃，5％CO2和95％的空气，含10％灭活小牛血清RPMI1640全培养基条件下(青霉素1×104IU/L，链霉素1×104μg/L)培养，取对数生长期细胞进行实验。每24h更换一次培养基，二恶英溶于DMSO，各实验组DMSO浓度始终≯0.1％。分别以不同浓度的二恶英染毒三个剂量组为1，2，3(10nM，，0.1μM，1μM)染24h，对照组加入细胞空白，二甲基亚砜(DMSO)。时间效应：设三个点，用10nM的二恶英处理后分别培养12h，24h，48h。SPC-A1细胞处理照材料与方法的那样，用PBS洗两次，0.25％的胰酶消化，调整细胞浓度为1×106，然后用4％多聚甲醛在室温下固定15分钟。进行HE染色，用乙醇脱水后在光学显微镜下观察细胞形态。琼脂糖凝胶电泳检测DNA断裂条带DNA电泳，用PI染色的方法来检测细胞的亚二培体调亡峰。样品处理前应制成单细胞悬液。细胞用PBS洗后，然后用70％的乙醇固定20℃，20小时。再用PBS洗，加PBS和PI(终浓度为50g/ml)。在室温避光10分钟，然后再用FCM检测。流式细胞仪对细胞凋亡分析，结果细胞凋亡可在10nMTCDD、0.1μMTCDD、1μMTCDD处理后24h出现。表现细胞固有形态丧失，核染色质固缩、碎裂和凋亡小体，并随作用浓度加大而更明显。SPC-A1的凋亡率分别为9.56％、16.8％、21.7％；A549的凋亡率分别为7.7％、13.6％、19.4％；HepG2的凋亡率分别为8.5％、14.5％、30％。均高于对照组。HE染色在光学显微镜下观察细胞形态，正常生长的SPC-A1细胞株呈圆形，细胞胞浆丰富，均匀，细胞核规整，呈蓝色，核内染色均一，当TCDD作用后，细胞均表现为细胞固有形态丧失，细胞变梭形，可见核固缩，碎裂和凋亡小体，并随作用的浓度加大而更明显。随着TCDD浓度的增大和作用时间的延长，SPC-A1细胞形态由贴壁的圆形变为梭形，贴壁细胞减少。悬浮细胞增多，并且细胞周围出现碎片凋亡细胞主要表现细胞体积缩小，核染色质固缩，亚二倍体峰出现。琼脂糖凝胶电泳结果对照组SPC-A1细胞DNA电泳主要表现为靠近加样孔附近完整的基因组DNA，而TCDD干预组SPC-A1细胞明显降解，可见明显的细胞凋亡的特征性梯状DNA条带。SPC-A1细胞生长曲线表明，随着TCDD浓度增高，生长率明显下降。流式细胞术检测结果用流式细胞术PI染色检测TCDD诱导SPC-A1细胞凋亡呈剂量依赖性，可见亚二倍体峰和DNAladder一样显示剂量关系。 结论:TCDD可能诱导此三种细胞发生凋亡。TCDD对SPC-A1细胞具有明显的体外细胞毒性作用.其毒性作用与TCDD的浓度和作用时间呈明显正相关.可以通过调亡诱导抑制细胞生长和增殖.TCDD能够诱导SPC-A1细胞凋亡，在10nM0.1μM，1μM范围内，其凋亡率呈浓度依赖性。TCDD诱导许多细胞产生凋亡已有报道，但TCDD对SPC-A1细胞在形态学上及在细胞再生没有报道。我们研究TCDD作用于SPC-A1细胞时是否引起凋亡。有以下结果表明：(i)形态学上，HE染色核固缩(ii)琼脂糖凝胶电泳检测，DNA断裂片段出“DNAladder

目录

第一章TSA或AzaC预处理增加TCDD诱导特殊细胞的P450基因表达水平

1前言

2材料与方法

3结果

4讨论

参考文献

第二章TCDD对肝癌细胞生长抑制及DNA损伤基因的诱导

1前言

2材料与方法

3结果

4.讨论

参考文献

第三章2，3，7，8-四氯二苯并-P-二恶英诱导癌细胞凋亡的研究

1前言

2材料与方法

3结果

4讨论

参考文献

第四章固相微萃取与气相色谱-质谱联用测定废水中的二恶英类化合物

1前言

2材料与方法

3结果

4讨论

参考文献

综述：二恶英毒性与生物检测研究进展

一 二恶英的化学结构及理化特性

二 二恶英对人和动物的毒作用机理

三 受体

四 二恶英活化基因转录

五 环境中二恶英的生物学检测

六 今后的研究方向

参考文献

致谢