香烟对气道平滑肌细胞蛋白激酶C的影响及其在哮喘气道重建发病机理中的意义

摘要

目的：众所周知，吸烟有害健康。香烟燃烧时产生的烟雾中含有数千种化学物质，其中数百种是有害有毒物质，这些有害有毒物质可引起多系统疾病，尤其是呼吸系统疾病，如慢性支气管炎、肺气肿、慢性肺心病、肺癌等。虽然目前尚无实验证实吸烟可直接引起支气管哮喘(简称哮喘)，但是已有研究证实香烟烟雾(cigarettesmoke，CS)可增加成人及儿童哮喘的发生频率及症状的严重程度。吸烟虽可作为哮喘发作的诱因是哮喘的恶化因子，但其原因尚不明确。 支气管哮喘的重要特征是慢性气道炎症、持续性气道高反应性(airwayhyperresponsiveness，AHR)和气道重建，三者相互作用，互为因果。气道重建是气道炎症和持续性气道高反应性长期存在的结果，可导致不可逆性的气流阻塞。气道平滑肌作为气道壁的重要组成成分，其细胞增殖在哮喘气道重建中起着重要作用，是不可逆性气流阻塞、持续性气道高反应性的重要病理基础。因此，探讨气道平滑肌细胞(airwaysmoothmusclecells，ASMCs)增殖的细胞内信号转导途径以明确哮喘发病机理、寻找更为有效的治疗方法，成为目前国内、外哮喘研究的热点之一。 蛋白激酶C(proteinkinaseC，PKC)是细胞内信号转导途径中的一种关键酶，是细胞外信号与细胞核反应间信号转导的共同通路，可参与多种细胞的增殖，在多种促有丝分裂因子诱导培养的非哮喘ASMCs的增殖中起重要作用；PKC有多种亚型，且每种亚型的结构和功能各不相同。此外，我们既往的研究表明PKC在哮喘模型大鼠及哮喘患者血清被动致敏人气道平滑肌细胞(HASMCs)增殖调控中亦起重要作用。但其详细机理尚需进一步研究。 香烟烟雾能使卵清蛋白(Ovalbumin，OVA)致敏的豚鼠气道炎症及持续性气道高反应性增加。国内研究表明香烟烟雾提取物(cigarettesmokeextract，CSE)可使家兔的ASMCs增殖活性增加。研究资料表明CSE可使多种细胞PKC活化。因而推测CSE可能通过激活PKC而在ASMCs的增值、转化、分泌等活动中起作用。 目前国内、外通常是分别研究与哮喘有关的各种影响因子对非哮喘ASMCs增殖的影响，但由于非哮喘ASMCs和哮喘ASMCs的表型和功能状态存在差异，这种在体外分别以单一因子诱导非哮喘ASMCs增殖来推断哮喘ASMCs体内的增殖特性及信号转导途径的方法尚存在一定局限性。故以来自哮喘个体的ASMCs为研究对象可能更准确地反映体内ASMCs增殖的信号转导途径。同时，由于哮喘患者的气道平滑肌细胞很难获得，国外研究者用变应性哮喘患者血清孵育人ASMCs，为研究哮喘发病机理提供了一个很好的被动致敏哮喘模型。 银杏叶(Ginkgo)制剂具有改善血液流变学、清除自由基、拮抗血小板活化因子(PAF)等作用，临床上主要用于治疗老年痴呆、心脑血管疾病、支气管哮喘和脏器移植的异体排斥等。 因此，本研究拟分动物实验(第一部分)和人体细胞实验(第二部分)两大部分，第一部分又分3个分题，第二部分又分2个分题，评价CSE对哮喘模型大鼠及被动致敏人ASMCs的PKC活性、亚型PKC-α、ζ表达及增殖特性的影响，评价香烟烟雾及银杏叶(Ginkgo)注射液对哮喘气道重建的影响，探讨CSE是否通过PKC途径参与了ASMCs的增殖和哮喘气道重建及银杏叶对哮喘气道重建是否具有抑制作用，为进一步明确哮喘发病机制、寻找更有针对性的治疗方法提供一些理论依据。 方法：本研究通过建立大鼠哮喘模型和大鼠哮喘烟熏模型，培养哮喘大鼠ASMCs；通过哮喘患者血清被动致敏人气道平滑肌细胞(HASMCs)，并应用CSE及PKC的激动剂PMA和特异性抑制剂Ro-31-8220等作为工具药干预上述细胞，采用同位素γ-32P-ATP催化活性测定法检测PKC的活性；用流式细胞术分析细胞周期、MTT法及氚标－胸腺嘧啶脱氧核苷(3H-TdR)掺入法检测上述细胞增殖活性；用RT-PCR技术检测细胞PKC-α及PKC-ζ的mRNA表达；用Westernblot检测细胞PKC-α及PKC-ζ的蛋白表达。评估CSE对哮喘模型大鼠及被动致敏人ASMCs的PKC活性、增殖特性及PKC亚型PKC-α、ζ表达的影响，探讨CSE是否通过PKC途径参与了ASMCs的增殖及哮喘气道重建，以更准确地反映CSE影响哮喘ASMCs增殖的调控机制。 另外，大鼠哮喘气道重建模型制备后，采用图像分析系统观察气道壁厚度和面积及天狼星红苦味酸染色观察气道壁胶原纤维沉积，采用RT-PCR和Westernblot法检测气道组织TGF-β1mRNA和蛋白质表达的变化，探讨CSE对哮喘大鼠气道重建的影响。 结果：1.哮喘组大鼠ASMCs的PKC活性、增殖及PKC亚型PKC-α、ζmRNA和蛋白表达均显著高于对照组ASMCs(P＜0.01)。与对照组比较，5％CSE及50nmol/LPMA均能促进哮喘组大鼠ASMCs的PKC活性、增殖及PKC亚型PKC-α、ζmRNA和蛋白表达的增加，其中以CSE+PMA组更为显著(P＜0.01)。哮喘组大鼠ASMCs和对照组大鼠ASMCs经5μmol/LRo-31-8220预处理后可消除5％CSE及50nmol/LPMA的作用；用5μmol/LRo-31-8220能抑制哮喘大鼠ASMCs的增殖及PKC亚型PKC-α、ζ的表达(P＜0.01)。2.哮喘烟熏组大鼠气道ASMCs增殖、气道壁厚度和面积及胶原面积显著高于哮喘组(P＜0.01)；哮喘组大鼠气道ASMCs增殖、气道壁厚度和面积及胶原面积又显著高于对照组(P＜0.01)。哮喘模型制备成功后，每天每次OVA激发后，再给予香烟烟雾吸入，连续8周，成功制备哮喘吸烟模型。3.哮喘血清被动致敏的HASMCs的PKC活性、增殖及PKC亚型PKC-α、ζmRNA和蛋白表达均显著高于对照血清处理的HASMCs(P＜0.01)。与对照组比较，5％CSE及50nmol/LPMA均能促进被动致敏的HASMCs的PKC活性、增殖及PKC亚型PKC-αmRNA和蛋白表达和PKC亚型PKC-ζ蛋白表达的增加，其中以CSE+PMA组更为显著(P＜0.01)。5μmol/LRo-31-8220能显著抑制被动致敏的HASMCs增殖及PKC亚型PKC-αmRNA和蛋白的表达(P＜0.05)。4.银杏叶注射液可以明显减弱哮喘烟熏组及哮喘组大鼠增加的气道壁厚度和面积、胶原面积及气道组织TGF-β1mRNA和蛋白质表达的程度。 结论：1.CSE使哮喘模型大鼠及被动致敏人ASMCs的PKC活性、增殖及PKC亚型PKC-α、ζmRNA和蛋白表达增加。2.CSE使哮喘模型大鼠及被动致敏人ASMCs的增殖及PKC亚型PKC-αmRNA和蛋白表达增加、PKC亚型PKCζ蛋白表达增加。3.CSE可能通过PKC途径增加哮喘大鼠和被动致敏人的ASMCs增殖。4.首次成功建立大鼠哮喘烟熏气道重建模型。5.CSE可能参与了哮喘模型大鼠的气道重建过程；CSE使气道组织TGF-β1mRNA和蛋白质表达增加。6.银杏叶可能通过部分减弱哮喘烟熏组及哮喘组大鼠增加的气道壁厚度和面积、胶原面积及气道组织TGF-β1mRNA和蛋白质表达的增加，从而对模型大鼠的气道重建具有抑制作用。 综上所述，本课题通过动物实验和人体细胞实验，结果表明CSE可能通过PKC途径参与了哮喘大鼠和被动致敏人的ASMCs增殖，对于从不同环节(如戒烟、避免烟雾吸入、应用中药银杏叶、PKC阻断剂、基因治疗等)针对性地抑制哮喘气道平滑肌增殖、减轻气道重建可能具有积极意义。

目录

缩略语一览表

第一部分动物实验

分题一香烟烟雾提取物对哮喘模型大鼠气道平滑肌细胞蛋白激酶C活性的影响

材料与方法

结果

讨论

参考文献

附图

分题二香烟烟雾提取物增加哮喘模型大鼠气道平滑肌细胞增殖及蛋白激酶C-α的表达

材料与方法

结果

讨论

参考文献

附录

分题三香烟烟雾及银杏叶对哮喘模型大鼠气道重建的影响

材料与方法

结果

讨论

参考文献

附图

第二部分人体细胞实验

分题一香烟烟雾提取物对蛋白激酶C在被动致敏的人气道平滑肌细胞增殖作用中的影响

材料与方法

结果

讨论

参考文献

附图

分题二香烟烟雾提取物对被动致敏人气道平滑肌细胞蛋白激酶C活性及蛋白激酶C-ζ表达的影响

材料与方法

结果

讨论

参考文献

附录

综述：蛋白激酶C与支气管哮喘的关系

研究生期间工作小结

致谢