依普拉芬防治去卵巢大鼠骨质疏松的实验研究及其NO调控机制探讨

摘要

目的：观察不同剂量的人工合成的植物雌激素—依普拉芬对去卵巢大鼠骨质疏松的防治作用；体外培养大鼠成骨细胞，观察依普拉芬对成骨细胞增殖和成骨分化的影响；检测依普拉芬对体外培养的大鼠成骨细胞和去卵巢大鼠一氧化氮(NO)以及一氧化氮合酶(NOS)生成的影响；探讨依普拉芬防治绝经后骨质疏松的作用以及NO调控机制，为其更好的在临床应用提供理论依据。
　　 方法：(1)60只SD雌性大鼠，随机分成六组：设一假手术组；腹腔手术切除大鼠双侧卵巢,分为阴性对照组、依普拉芬低、中、高剂量组和雌激素对照组，分别给予基础饲料和不同剂量受试物，12周后进行骨密度、骨组织形态计量、生物力学以及骨代谢指标测定，与雌激素对照，观察给与依普拉芬对绝经后骨质疏松的防治作用。(2)体外分离、培养、纯化新生大鼠颅盖骨成骨细胞，碱性磷酸酶染色及矿化结节染色鉴定，将不同浓度的依普拉芬加入培养液，测定细胞增殖情况、碱性磷酸酶(ALP)活性及钙化结节。与雌激素对照，了解依普拉芬对成骨细胞增殖和分化的影响。(3)体外分离培养新生SD大鼠颅盖骨成骨细胞，取第二代细胞，培养液中分别加入不同浓度的依普拉芬，72小时后，测定各组细胞培养基中的NO浓度，RT-PCR方法检测各组细胞中内皮型一氧化氮合酶(eNOS)mRNA的表达。(4)按第一部分方法建立绝经后骨质疏松模型及分组，给与受试物12周后测定大鼠血清一氧化氮(NO)以及一氧化氮合酶(NOS)含量。用免疫组织化学方法检测骨组织中eNOS以及iNOS的表达。
　　 结果：(1)大鼠去卵巢后骨密度显著下降,股骨的力学性能以及骨代谢指标有较大变化，弯曲强度和弯曲弹性模量明显降低。给予依普拉芬后,可使骨密度显著提高(P<0.01),存在一定的剂量-效应关系,同时弯曲强度和弯曲弹性模量明显增加，但均低于雌激素对照组。(2)与阴性对照组相比，各浓度组的依普拉芬均可增加成骨细胞数量(P<0.01),提高成骨细胞的ALP活性和促进钙化结节形成(P<0.01)。其中10-8～10-5mol/L作用更为显著。(3)与阴性对照组相比，各浓度组的依普拉芬均可增加成骨细胞培养液中的NO浓度并促进 eNOS mRNA的表达(P<0.01)。其中10-8～10-5mol/L之间作用更为显著。(4)与假手术组相比，去卵巢大鼠阴性对照组血清NO、NOS浓度以及股骨eNOS表达均明显降低，依普拉芬各剂量组高于阴性对照组，与假手术组差异无显著意义。同时低于雌激素组。
　　 结论：依普拉芬对去卵巢大鼠具有显著的骨保护效应,同时可以促进大鼠成骨细胞的增殖和成骨分化，并存在一定的剂量效应关系，其作用弱与雌激素。依普拉芬防治绝经后骨质疏松作用可能是通过NO-NOS系统进行调控的。