毛细管电泳-连续光多光子激发荧光检测系统的研制和应用研究

摘要

历经20 多年的发展，高灵敏、高分辨、高速度、低样品消耗的微分离分析-毛细管电泳(Capillary Electrophoresis，CE)以其多元化的分离模式和多样化的联用探测方式，成为分离分析领域的一个强有力的研究手段，广泛应用于各领域，尤其在生命科学领域。多光子激发荧光(Multiphoton Excited Fluorescence，MPEF or MPE)拥有超高的空间分辨率(亚飞升水平)、高灵敏度(单分子)、深度穿透、较低光毒性和光漂白等诸多优点，在生物医学领域应用广泛。Shear 等首先将多光子激发荧光和毛细管电泳结合起来，即建立了全新的CE-MPEF分析系统，在zmol 水平探测了自发荧光生物分子和荧光标记的神经递质。由于其采用飞秒锁模Ti:sapphire 激光器，价格昂贵、操作复杂、维护和运行成本高，限制了CE-MPEF的推广和应用。近年来，半导体激光器的制造技术发展迅速，近红外波长、大功率、长寿命和小巧价廉的半导体激光器的出现，有望成为理想的荧光激发光源。
　　 本论文采用半导体激光器作为多光子激发荧光的激发光源，建立一新型毛细管电泳-多光子激发荧光(CE-MPEF)检测系统，并对CE-MPEF的探测模式进行了改进，进而开展了相关的应用研究。主要研究内容和结果如下：
　　 (1)采用廉价的半导体激光器取代昂贵的Ti:Sapphire 飞秒激光器，构建了以连续光(Continuous Wave Laser Diode，CW-LD)多光子激发荧光为检测手段的毛细管电泳系统(CW-LD CE-MPE)。采用本系统实现了以小分子荧光染料、量子点和荧光蛋白作为样品的电泳分离和荧光检测，并论证了检测的荧光为多光子激发荧光；进而在毛细管区带电泳(CZE)和胶束电动色谱(MEKC)两种分离模式下，实现异硫氰酸荧光素(FITC)标记的多种氨基酸分子的分离和多光子激发荧光检测；实验表明：
　　 LD作为CE-MPE系统的激发光源是可行的。
　　 (2)设计了一个适合CE-MPEF系统荧光检测的检测器。比较了圆形和方形毛细管不同几何规格对电泳分离效果的影响，设计了方形和圆形毛细管结合的柱上检测器，并成功地用于本CE-MPEF系统的检测。实验表明：方形和圆形毛细管结合的柱上检测器即保留了圆形毛细管良好的电泳分离效果，又提高了多光子激发荧光探测灵敏度(检测限提高了2～5 倍)。
　　 (3)采用CW-LD CE-MPEF系统，对比单光子激发荧光的LIF-CE系统，在MEKC分离模式下，对21种FITC 标记的氨基酸进行了电泳分离和多光子激发荧光检测。实验证明：系统有较高的分离效率，完全实现21种FITC 标记的氨基酸的基线分离；在定量分析的线性校正曲线区间(2个数量级)，质量检测限(zmol)和浓度检测限(μM)的基础上，分析了八峰氨基酸口服液，检测分析的氨基酸含量与厂家提供的数据基本一致(误差＜5％)。
　　 (4)本系统成功地应用于腐胺等6种生物胺标样分析和常温保存的鲜鱼腐液中胺类物质分析。结果显示，系统可以用于食品胺类检测，为食品安全提供了一种分离效率高、质量检测灵敏度高和低消耗，且适于复杂体系测量的分析手段。
　　 (5)采用本系统对持久性有机污染物(POPs)类环境恶性污染物，进行了分析，在优化了衍生条件和分离条件基础上，对苯胺等4种POPs 物质进行了电泳分离和多光子激发荧光探测；并对东湖水水体POPs 类物质进行了分析，为环境POPs 物质的监控提供了新的分离和探测手段。
　　 (6)多光子激发荧光技术具有超宽的激发光谱，适合多标记复合测量。例如，本CE-MPEF系统成功地同时实现了不同谱线波长的6种荧光染料分子的多光子激发荧光激发和收集，这对于单光子激发而言，是不可能用单一谱线实现同时激发的。采用本系统对FITC 标记的DNA样本进行了分析；实验表明：采用近红外的单一谱线激光器，是可以同时实现4种荧光标记的多光子激发荧光，它为DNA 测序提供了新颖的超低成本的检测方法。