β-分泌酶活性及其二聚化的动态光学成像研究

摘要

阿尔茨海默症(AD)是一种常见的中枢神经系统退行性疾病，临床表现为渐进的记忆丧失和认知障碍，是老年痴呆的一种主要类型。目前普遍认为β-淀粉样肽(Aβ)在AD 患者脑内的产生、聚集和沉积在阿尔茨海默症的发病机理中扮演着重要的角色。而β-分泌酶(BACE)对淀粉样前体蛋白(APP)的酶解是Aβ产生的关键限速步骤，因此BACE 成为AD药物治疗的一个重要靶标，发展检测BACE 活性的技术和对BACE 结构的了解对于药物的开发和筛选都具有重要意义。然而传统的生化方法难以实现在活细胞生理条件下对BACE的酶活性和结构的实时动态研究。本文利用荧光能量共振转移(FRET)光学成像技术，结合基因工程技术合成的FRET探针和荧光标记蛋白，在活细胞水平检测了BACE的活性及其二聚化结构。主要的研究结果如下：
　　 ⑴利用基因工程技术构建了五种基于绿色荧光蛋白(GFP)的可遗传编码的FRET探针。这些FRET 探针由GFP的两个颜色突变体——青色荧光蛋白(CFP)和黄色荧光蛋白(YFP)，及其之间的一段短肽构成。根据中间连接短肽序列的不同，获得了4种中间短肽为BACE 识别底物位点(BACE substrate site，BSS)的FRET 探针：YβCwt(野生型BSS)、YβCSweS(Sweden 突变的短链BSS)、YβCSweL(Sweden 突变的长链BSS)、YβCNFEV(‘NFEV’突变的BSS)，和1种中间短肽为随机序列的对照探针YcC。利用荧光光谱扫描和SDS-PAGE 凝胶电泳比较了五种探针的体外荧光特性和酶切效果。结果显示，五种荧光探针都具有较强的FRET 效率；中间短肽为BSS的YβCwt、YβCSweS、YβCSweL、YβCNFEV的酶切效率依次增强，而对照探针YcC 不能被BACE酶切。
　　 ⑵由于BACE 及其底物APP 均为分泌的跨膜蛋白，为了在活细胞水平检测BACE的活性，将经体外验证的FRET 探针构建到真核表达载体pDisplay 中，获得真核表达的FRET 探针dYβC(displayed YβC)和对照探针dYcC(displayed YcC)。共聚焦荧光成像结果显示，在BACE 阴性的HeLa 细胞内，表达的dYβC和dYcC 能够进入分泌途径，展示在细胞膜上，并显现出很高的FRET 效率。当共转染BACE 到HeLa细胞内时，dYβC的FRET 效率明显降低，而对照探针dYcC的FRET 效率始终保持不变。此结果表明dYβC 可在活细胞中被BACE 有效酶切，可用于动态检测活细胞内的BACE 活性，为BACE 抑制剂的开发提供了一个活细胞筛选的平台。此外，利用该探针分析了BACE在分泌途径中具备酶活性的起始位点，证实BACE 早在内质网中就具有酶活性，能够对其底物进行酶切。
　　 ⑶为了研究BACE在活细胞中的存在形式，构建了CFP和YFP 标记的全长BACE(BACE-FL)和BACE 活性部分(BACE-NT)。共聚焦荧光成像和受体漂白FRET 实验结果显示，BACE-FL 能够定位到高尔基体、质膜、内涵体等细胞器中，而BACE-NT则被滞留在内质网里；BACE-NT是单体结构，而BACE-FL在活细胞内则以二聚体的形式存在。证明BACE的跨膜序列和C-末端对BACE的转运和定位具有重要作用，其二聚体结构由这些序列决定，而不由酶的活性位点决定。