氧化应激和JNK信号途径介导的INS-1细胞高糖毒性作用机制研究

摘要

葡萄糖是生理条件下调节胰岛β细胞功能的重要营养物质。机体存在一定数量功能正常的β细胞是维持糖稳态的基础。胰岛β细胞功能减退导致葡萄糖代谢异常，促进糖尿病发生。显著的高血糖通过糖毒性作用进一步损害β细胞功能是加速糖尿病病情进展的病理生理机制。氧化应激是指体内的活性氧（ROS）生成增加和(或)清除活性氧的能力降低，导致活性氧生成和清除失衡，机体内过量的活性氧聚集导致组织、细胞功能受损。2型糖尿病患者因为高血糖、高血脂导致机体氧化应激反应发生，过量的能量物质代谢同时加重胰腺组织内的氧化应激反应，导致活性氧产生增加。在胰岛细胞内活性氧的产生与血糖的关系如何，高血糖是否通过胞内活性氧损害了β细胞功能，氧化应激是否参与形成糖毒性的机制是本课题研究的内容之一。机体内的各种信号系统通过相互作用调节细胞功能。胰岛素信号系统主要在胰岛素靶器官表达，具有调节胰岛β细胞功能和外周组织胰岛素敏感性的重要地位。β细胞上的胰岛素受体信号系统受损导致β细胞功能损害。JNK信号分子属于应激激活蛋白激酶家族中的成员，在机体受到创伤、炎症反应、放射线照射时被激活，通过活化其下游底物主要调节细胞的生长与存活。β细胞内存在JNK信号分子的表达，本研究通过观察高糖环境是否激活β细胞内的JNK 信号通路以及JNK信号通路与胰岛素受体信号系统是否相互作用介导糖毒性的产生，从而为有效地减轻糖毒性，保护β细胞功能提供有价值的干预分子靶点。 一、不同葡萄糖浓度下培养INS-1细胞，检测细胞的活性与凋亡、基因转录功能。 1、观察不同浓度的葡萄糖作用不同时间对β细胞系INS-1细胞活性和凋亡的影响：在5.6mmol/l（5.6G）、11.2mmol/l（11.2G）、33.3mmol/l（33.3G）葡萄糖浓度下培养INS-1细胞48、72小时，MTT方法检测细胞活性，免疫荧光Hoechst染色和Annexin V-FITC/PI双标记流式细胞术检测细胞凋亡。RT-PCR方法检测细胞胰岛素、PDX-1、IAPP的mRNA转录水平，加入IGF-1以后检测细胞活性和基因转录水平改变。 2、高糖随时间增加对INS-1细胞功能损伤程度加重：MTT活性检测显示一定范围内的葡萄糖浓度增加促进细胞活性；随葡萄糖浓度进一步增加，细胞活性受抑制；72小时，33.3mmol/l葡萄糖浓度下，细胞活性抑制达17.7％（p<0.001）；Hoechst染色显示培养72小时只有33.3G组INS-1细胞有明显凋亡；流式细胞术检测培养细胞72小时后33.3G组凋亡细胞比例为28.2％，是基础对照组的2.49 倍（P<0.001）。随葡萄糖浓度和培养时间增加，INS-1细胞的胰岛素、PDX-1基因转录受抑制程度逐渐增加；加入细胞因子IGF-1以后可以改善细胞活性、增加胰岛素和PDX-1的转录水平，但随葡萄糖浓度增加，其促进生长的作用减弱；培养48小时，11.2mmol/l、33.3mmol/l葡萄糖抑制IAPP的基因转录；长期高糖培养（72 小时），IAPP基因转录增强。IGF-1抑制IAPP的基因转录。 二、检测不同浓度葡萄糖培养下INS-1细胞内活性氧（ROS）的水平，以及给与活性氧清除剂NAC以后，细胞功能的改变。 1、胞内活性氧随葡萄糖浓度增加而增加：培养48小时，11.2G和33.3G组胞内ROS较对照组分别上升15％和32％，（P<0.001）。培养至72小时，11.2G组和33.3G组胞内ROS较对照组分别增加25.3％和49.6％（P<0.001），给与NAC显著降低不同糖浓度下的胞内活性氧水平。 2、活性氧清除剂NAC改善高糖环境中的INS-1细胞功能：加入NAC有效地改善了高糖环境中的INS-1细胞活性，48小时和72小时，33.3G组细胞活性较干预前分别增加28％和20％（P＜0.01）；细胞凋亡减少54％（P<0.001）；胰岛素、PDX-1基因转录水平显著提高，48小时内可以完全逆转高糖环境中的胰岛素基因转录水平。 三、研究高糖损伤INS-1细胞功能的分子机制。 1、阻断INK信号通路可以有效地改善INS-1细胞功能：给与JNK抑制剂SP600125以后，48小时内有效改善高浓度葡萄糖对INS-1细胞活性的抑制作用，72小时33.3G组细胞凋亡减少45％（P<0.001），表明JNK的激活在糖毒性导致的β细胞凋亡中发挥了作用。此外高糖环境中的INS-1细胞胰岛素和PDX的基因转录水平也在阻断JNK通路后获得部分恢复。 2、高糖通过激活JNK信号通路进而抑制胰岛素信号系统可能是糖毒性损伤胰岛β细胞的分子机制之一高糖环境激活INS-1细胞的JNK丝氨酸磷酸化，IGF-1抑制该位点的磷酸化过程。同时高糖培养可以激活IRS-ser-270磷酸化，33.3G组磷酸化水平是11.2G组的1.17倍（P<0.01）。加入JNK抑制剂SP600125以后，各葡萄糖组JNK磷酸化水平显著降低，33.3G组JNK磷酸化蛋白被抑制90％；加入SP600125后11.2G组和33.3G组IRS-Ser-270的磷酸化水平只是部分被抑制，分别下降88.3％和80％；加入IGF-1进一步抑制IRS-Ser-270的丝氨酸水平。葡萄糖毒性部分通过激活JNK信号途径进而抑制INS-1细胞的胰岛素受体底物信号系统发挥作用。 结论： （1）一定浓度范围内的葡萄糖促进INS-1细胞存活与生长。 （2）慢性长期高糖环境抑制INS-1细胞的活性、促进细胞凋亡，损害其基因转录功能。 （3）高糖诱发INS-1细胞发生胞内氧化应激，给与抗氧化应激干预显著抑制胞内氧化应激，并有效的改善细胞活性、减少细胞凋亡，促进胰岛素和PDX-1的基因转录。 （4）高糖通过激活JNK磷酸化，进一步导致IRS-Ser-270磷酸化；阻断JNK 信号通路，抑制其磷酸化过程进而部分抑制IRS-Ser-270的磷酸化，显著改善INS-1细胞功能。 （5）高糖通过诱导INS-1细胞内的氧化应激，激活JNK诱导IRS的丝氨酸磷酸化，从而抑制胰岛素信号系统可能是高糖毒性的机制之一。