香菇多糖联合丙肝核酸疫苗诱导抗原特异性免疫反应的研究

摘要

第一部分、丙型肝炎病毒非结构蛋白3（NS3）DNA疫苗的制备与鉴定。 目的：大量制备丙型肝炎病毒非结构蛋白3（NS3）DNA疫苗，并进行定量及定性分析，为进一步研究其免疫活性奠定基础。 方法：将pcDNA3.1-HCV/NS3转化感受态大肠杆菌HB101，克隆后挑取单个菌落扩增，用超纯质粒大量快速提取试剂盒提取pcDNA3.1-HCV/NS3，提取物分别进行核酸定量检测和琼脂糖凝胶电泳鉴定。 结果：本试验成功的转化pcDNA3.1-HCV/NS于大肠杆菌中，铺平皿温育16h后有较多的单菌落生长。扩增提取产物经核酸定量检测，浓度在1.5μg/μl－2μg/μl范围内，纯度均接近1.8，因免疫小鼠所需要的DNA浓度为1μg/μl，所以提取的DNA在浓度和纯度上符合要求，另将扩增提取产物双酶切后经琼脂糖凝胶电泳证实扩增的质粒DNA包含目的基因NS3片段，分子量为1.8Kb。 结论：本实验成功制备了用于免疫动物的HCV/NS3 DNA疫苗，为进一步研究其免疫活性奠定了基础。 第二部分、香菇多糖作为免疫佐剂对丙肝病毒非结构蛋白3（NS3）体液免疫效果的影响。 目的：探讨中药香菇多糖（LNT）作为免疫佐剂对HCV/NS3核酸疫苗体液免疫效果的影响。 方法：HCV-NS3核酸疫苗肌注免疫BALB/c小鼠（100μg/只），10天后加强免疫一次，同时灌胃给予高(1mg/ml)、中(0.5mg/ml)、低(0.1mg/ml)三种剂量的香菇多糖，于末次免疫后第1、3、5周分别采集小鼠尾血，分离收集血清冻存。用HCV/NS3抗原多肽包被酶标板，采用间接酶联免疫吸附实验（ELISA）法检测小鼠血清特异性IgG抗体水平。并采用ELISA方法检测血清中细胞因子IL-4和IFN-g分泌水平。 结果：二次免疫后1周各组免疫小鼠血清中均产生了不同水平的抗体，以中剂量LNT为佐剂的免疫组在各时间点产生的特异性IgG水平最为显著，而且随着时间的增加，中剂量LNT为佐剂的免疫组和单独免疫核酸疫苗组的特异性IgG水平呈现出上升的趋势，而以高剂量和低剂量的LNT为佐剂免疫组的抗体水平随时间变化不大；中剂量香菇多糖为佐剂免疫组产生的特异性抗体水平较单独免疫核酸疫苗组在各时间点均有显著性提高（P<0.05）。细胞因子分析显示以不同剂量香菇多糖作为佐剂的免疫组较之单独免疫核酸疫苗组IFN-γ的分泌增加，其中中剂量的香菇多糖联合HCV/NS3核酸疫苗组产生IFN-γ的水平较之单独使用核酸疫苗组，差异非常显著（P<0.01）。而IL-4水平各组间无明显差异（P＞0.05）。 结论：通过二次肌注免疫HCV/NS3核酸疫苗，小鼠体内产生了抗NS3抗原的特异性IgG抗体，而且随着时间的延长，特异性抗体水平也随之升高。中剂量的香菇多糖为佐剂能够增强HCV/NS3核酸疫苗诱导的特异性体液免疫反应。香菇多糖能够刺激Th1类细胞因子IFN-γ分泌，而对Th2类细胞因子IL-4的分泌未明显影响。 第三部分、香菇多糖作为佐剂对丙肝病毒非结构蛋白3（NS3）细胞免疫效果的影响。 目的：探讨中药香菇多糖（LNT）联合丙型肝炎病毒（HCV）非结构蛋白NS3核酸疫苗诱导NS3抗原特异性细胞免疫作用。 方法：将不同剂量的香菇多糖与HCV/NS3质粒（100mg/只），采用初次加强免疫法联合免疫BALB/c小鼠。第二次免疫10天后取小鼠脾脏，制备脾细胞悬液，与NS3多肽抗原共同孵育作为效应细胞。另培养NS3抗原致敏的P815细胞作为靶细胞。采用MTT法分别检测NS3抗原特异性T细胞增殖反应和细胞毒T细胞特异性杀伤反应（CTL）。 结果：研究发现中剂量和低剂量香菇多糖与NS3 质粒联用明显增强NS3抗原特异性T细胞增殖反应（P<0.05）。高剂量及中剂量香菇多糖与HCV/NS3核酸疫苗联合应用，在效靶细胞比为50:1和25:1时，可诱导更强NS3抗原特异性CTL反应，与单独免疫NS3 质粒相比有显著性差异（P<0.05）。而低剂量的香菇多糖佐剂免疫组的CTL杀伤率与单独使用核酸疫苗组相比没有明显差异。总的趋势是随着效靶细胞比值（E/T）的增大，效应细胞对靶细胞的杀伤力也增大。 结论：采用初次加强免疫法将中剂量香菇多糖(0.5mg/ml) 与HCV/NS3核酸疫苗联合免疫BALB/c小鼠，可激发明显增强的抗原特异性T细胞增殖和 CTL反应，并结合试验第二部分的细胞因子分析结果，提示香菇多糖作为丙肝病毒NS3核酸疫苗的免疫佐剂，可加强抗原特异性免疫应答效应。