尿路组织工程研究中不同部位来源脂肪干细胞生物学特性的比较

摘要

目的：观察、比较兔不同部位脂肪干细胞(adipose-derived mesenchymal stem cells，ADSCS)在体外培养时的生长特性，评价不同来源部位是否与其生物学性能存在联系，以便选取优良的种子细胞用于下一步尿路组织工程研究，同时为深入研究ADSCS生长特性具体的影响因素提供实验基础。
　　 方法：应用酶解法(I型胶原酶)分离出附睾附近、腹膜后、颈背部三个部位脂肪中的间充质干细胞，进行体外传代后差速贴壁培养纯化，比较不同培养方案的细胞状态，观察四代以后三个不同部位ADSCS的形态特征和生长状态，用鼠源性兔CD44分子的单克隆抗体做免疫细胞化学染色给予干细胞鉴定，对纯化后的三部位第五代间充质干细胞进行成脂、成骨、成肌多向诱导分化，采用“油红O”染色法对成脂诱导后细胞性质进行鉴定，VON KOSSA钙染色法对成骨诱导细胞进行鉴定，RT-PCR法对成平滑肌诱导细胞进行肌肉早期标志物α-Actin基因的检测，MTT法检测差速贴壁培养后不同部位细胞的生长曲线和倍增时间并进行统计分析和比较。
　　 结果：
　　 ⑴兔三个部位脂肪组织颜色均为淡黄色；附睾附近脂肪较多且存有明显脂肪外包膜，其它细胞成分污染机率较小。
　　 ⑵等量脂肪情况下，附睾附近和颈背部脂肪的原代ADSCS产量较多。
　　 ⑶三个部位ADSCS原代及传代细胞形态：原代细胞形态较小，呈长梭形或多边性贴壁生长；传代后差速贴壁培养的细胞形态增大，呈铺路石样分布，生长、迁移活跃。
　　 ⑷兔ADSCS标志CD44分子免疫细胞化学染色阳性，分布处呈棕黄色颗粒沉淀。
　　 ⑸兔三个不同部位来源ADSCS多向诱导分化：诱脂分化后油红染色可见红色脂滴；诱骨分化后VON KOSSA钙染色可见细胞外基质物状黑色钙沉积；诱平滑肌六周后对照组α-Actin标志物经RT-PCR检测显示弱条带，实验组则呈强条带。
　　 ⑹兔三个部位ADSCS生长曲线及倍增时间：颈背部和附睾附近来源ADSCS间的倍增时间差异无统计学意义(P>0.05)，而生长速度较快的颈背部和附睾附近来源ADSCS分别与腹膜后来源的ADSCS的倍增时间有明显差异(P<0.01)。
　　 结论：
　　 不同部位来源的ADSCS在体外培养时其生物学特性存在差异，部位来源成为影响其增殖、分化能力的另一重要因素，这提示在后续的尿路组织工程基础研究中，对ADSCS的来源部位要有所择取，颈背部和附睾附近来源ADSCS成为较佳种子细胞。