水中病毒膜吸附洗脱和免疫磁珠吸附法研究

摘要

目的：(1)优化滤膜吸附-洗脱法富集水体病毒的反应条件，以便有效富集水体病毒(2)制备脊髓灰质炎病毒多克隆抗体，构建免疫磁珠，探讨免疫磁珠捕获法富集水体病毒的可行性。
　　 方法：(1)采用膜吸附洗脱法初次浓缩水体病毒，调节水样pH 值和Al 3+浓度，比较不同pH 值、有无金属阳离子情况下，水体中病毒的回收率，根据回收率高低选择最佳条件进行病毒富集。(2)采用聚乙二醇（PEG）6000 沉淀法二次浓缩水体病毒，配制不同浓度的PEG6000 溶液，比较各浓度下病毒回收率的高低，选择合适浓度进行病毒二次浓缩。(3)将不同滤膜和不同洗脱液组合进行序贯试验，比较各组合回收率，选择最佳组合进行病毒富集。(4)用纯化的脊髓灰质炎病毒抗原免疫日本大白兔，皮下多点注射，制备脊髓灰质炎病毒多克隆抗体，间接ELISA法测定抗体效价，核酸蛋白仪测定抗体浓度。将制备的脊髓灰质炎病毒多克隆抗体与微磁珠偶联构建免疫磁珠，富集水体病毒，实时定量PCR法检测病毒回收量，计算病毒回收率，评价免疫磁珠捕获法对病毒的吸附效果。
　　 结果：(1)pH=4.0时，病毒回收率为70.81%，较其他pH 值高；加AlCl3的病毒回收率76.73%较不加AlCl3的55.51%高；病毒回收率随PEG6000 浓度增加而增大，PEG6000 浓度在120g/l时，病毒回收率可达85.90%，继续增加PEG6000 浓度，病毒回收率变化不明显；将混合纤维素酯滤膜和H2SO4/NaOH 洗脱液组合，病毒回收率为75.17%，病毒富集效果较其他组合好。(2)纯化后抗体效价为1：8000，抗体浓度12.87mg/ml，用纯化的抗体包被空白磁珠，空白磁珠对脊髓灰质炎病毒多克隆抗体的饱和吸附量为143.5 μg/mg，将制备的免疫磁珠加入到不同浓度脊髓灰质炎病毒液中，在100 倍稀释的病毒液中可回收63.67%。
　　 结论：(1)水体中加入多价金属阳离子可增加病毒回收率；不同pH条件下，病毒回收率不同，pH=4.0时，病毒回收率最高；混合纤维素酯滤膜吸附，H2SO4/NaOH洗脱液洗脱，病毒富集效果好；增加PEG6000 浓度可提高病毒回收率，当PEG6000 浓度在120g/l时，病毒回收率可达85%以上，效果较好。(2)成功制备脊髓灰质炎病毒多克隆抗体，效价较高；抗体包被磁珠效果并不理想，尚不清楚是由磁珠氨基化修饰或抗体偶联哪一过程引起。最后将免疫磁珠应用到水体病毒富集中，虽然效果不及膜吸附洗脱法，但回收率尚可，本过程未考虑磁珠浓度、病毒浓度、水体pH 值、水中有机干扰物等对病毒回收率的影响，有待进一步研究。