VKDC/VKOR在草酸钙尿石形成过程中的作用及分子机制的初探

摘要

本研究分为三部分：
　　 第一部分：维生素K依赖性羧化酶(VKDC)在草酸钙尿石症患者肾组织中活性及表达的研究
　　 目的：对草酸钙尿石症患者肾组织中维生素K依赖性羧化酶（VKDC or GGCX）的活性及表达进行检测，探讨其与草酸钙尿石形成的关系。
　　 方法：收集肾脏皮质组织标本71例，其中草酸钙尿石组44例，对照组27例（肾盂输尿管交界处狭窄和输尿管结核组6例，肾肿瘤皮质组21例）。采用超速离心提取羧化酶，运用同位素标记的羧化反应检测尿石症患者肾组织VKDC活性；应用免疫组织化学法确定VKDC在肾脏皮质组织中的表达部位，应用免疫印迹（Western blot）蛋白半定量法，检测各组VKDC蛋白的表达。
　　 结果：草酸钙尿石症患者肾组织中VKDC活性显著低于对照组。VKDC在结石组和对照组中均有表达，主要位于肾皮质肾小管上皮细胞的胞浆，但在尿石组中的表达(27.64±0.29)明显低于对照组(53.78±0.33、55.22±0.36)，差异有统计学意义（P<0.05）。
　　 结论：VKDC在草酸钙尿石症患者肾组织的活性和表达均降低，这些改变可能与草酸钙尿石的形成有关。
　　 第二部分：草酸钙尿石症患者肾组织γ-羧基谷氨酸羧化酶基因3'-非翻译区变异的初步研究
　　 目的：探讨γ-羧基谷氨酸羧化酶（GGCX）基因3'-非翻译区（3'-untranslated region，3'-UTR）的分子变异及与草酸钙尿石症的关系。
　　 方法：收集肾脏皮质组织标本，其中草酸钙尿石组42例，对照组31例（非尿石组及肾肿瘤组），提取肾脏组织RNA后采用快速cDNA末端扩增（RACE）技术扩增GGCX基因的3'-UTR，将扩增的特异带回收纯化，构建到原核表达载体中，提取质粒后进行酶切鉴定，并测序后与NCBI核酸数据库进行比对。
　　 结果；GGCX基因第一次套式PCR扩增未见明显特异带，2次套式PCR结果可见约1000bp特异带，回收后连接到pGEM-T中，转化到大肠杆菌中并少选阳性菌落，提取质粒进行酶切鉴定后测序，于NCBI核酸数据库进行比对，结果未发现该段序列存在插入或缺失。
　　 结论：草酸钙尿石患者VKDC表达下调可能与γ-羧基谷氨酸羧化酶（GGCX）基因的3'非翻译区无明显相关。
　　 第三部分：维生素K环氧化物还原酶亚单位1在草酸钙尿石症患者肾组织中的表达及与草酸钙尿石形成关系的研究
　　 目的：探讨草酸钙尿石症患者肾组织中维生素K环氧化物还原酶亚单位1（VKORC1）的表达及意义。
　　 方法：收集肾脏皮质组织标本71例，其中草酸钙结石组44例，对照组27例（肾盂输尿管交界处狭窄和输尿管结核组6例，皮质厚度小于1.0cm；肾肿瘤皮质组21例，皮质厚度大于1.0cm），应用免疫组织化学法检测VKORC1在组织中的表达部位，应用免疫印迹（Western blot）蛋白半定量法，检测各组VKORC1蛋白的表达，并分析其表达与肾脏积水及皮质厚度等因素的关系。
　　 结果；VKORC1定位于肾皮质肾小管上皮细胞的胞浆。对照组间VKORC1的表达（262.16±7.33和286.71±9.82）无明显差异，P>0.05，但结石组VKORC1蛋白的表达（122.33±11.34）明显低于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。
　　 结论：草酸钙尿石症患者肾组织内VKORC1表达降低在草酸钙尿石形成中有重要作用，并可能通过维生素K循环作用于VKDC而发挥机制。