HBcAg融合蛋白DNA疫苗的免疫保护力在小鼠模型上的研究

摘要

目的：1.构建3种免疫细胞表面分子的胞外段与乙型肝炎病毒核心抗原（HBcAg）融合蛋白的真核表达质粒：pwCTLA-4-HBc、pmCD27-HBc和pmCD40L-HBc，并检测其编码的融合蛋白在真核细胞中的表达和分泌情况。2. 了解以上构建的3种质粒：pwCTLA-4-HBc、pmCD27-HBc和pmCD40L-HBc 以及2个对照质粒：单纯表达HBcAg的质粒pHcex和单纯表达HBeAg的质粒pHeex电击免疫诱导小鼠体液免疫应答和细胞免疫应答的情况。3. 了解质粒DNA 疫苗pwCTLA-4-HBc和pHcex在小鼠尾静脉高压水注射感染性克隆模型上的免疫保护效力。
　　 方法：1．利用分子克隆技术分别构建真核表达质粒pwCTLA-4-HBc、pmCD27-HBc和pmCD40L-HBc。经酶切鉴定、间接免疫荧光方法、转染上清和细胞裂解液酶联免疫吸附实验（ELISA）检测融合蛋白表达，证实其构建成功。2．将质粒pwCTLA-4-HBc、pmCD27-HBc、pmCD40L-HBc和对照质粒pHcex和pHeex采用肌肉注射联合电击免疫小鼠；采集系列血清间接ELISA 有限稀释法检测小鼠产生的抗HBV 核心抗原的总IgG和IgG2a/IgG1亚型抗体的滴度，了解其体液免疫应答情况和Th1/Th2 型细胞免疫应答的情况；3次免疫后4周处死小鼠，用IFN-γ的酶联免疫斑点实验（ELISPOT）检测核心抗原CTL表位肽刺激下产生IFN-γ的小鼠脾脏淋巴细胞的相对数量，了解其特异性CTL细胞免疫应答的情况。3．选取2种质粒pwCTLA-4-HBc和pHcex 同样方案免疫小鼠，完成免疫周期后2周，尾静脉高压水注射pAAV/HBV1.pAAV/HBV 1.2；采集系列血清：ELISA 定性检测小鼠产生HBsAg的情况，了解HBV表达情况；荧光实时定量PCR （realtime PCR）检测血清中HBV DNA的拷贝数（copy number），了解HBV 复制情况。尾静脉高压水注射后29和33天分别放血和处死各组的半数小鼠，分离血清间接ELISA有限稀释法检测小鼠产生的抗HBV 核心抗原和抗HBV表面抗原的总IgG和IgG2a/IgG1亚型抗体的滴度，了解其体液免疫应答情况和Th1/Th2 型细胞免疫应答的情况；用IFN-γ的酶联免疫斑点实验（ELISPOT）检测核心抗原和表面抗原CTL表位肽刺激下产生IFN-γ的小鼠脾脏淋巴细胞的相对数量，了解其特异性CTL细胞免疫应答的情况。
　　 结果：1．构建质粒pwCTLA-4-HBc、pmCD27-HBc、pmCD40L-HBc和对照质粒pHcex、pHeex转染的BHK细胞可检测到HBc抗原特异性免疫荧光，转染Hela细胞后细胞裂解液和培养上清中针对HBeAg的ELISA 反应强弱不等，但模式与预期吻合。2．构建质粒pwCTLA-4-HBc、pmCD27-HBc、pmCD40L-HBc和对照质粒pHcex、pHeex免疫小鼠，3次免疫周期结束，小鼠均能产生强弱不等的针对HBV 核心抗原的抗体应答，其产生抗体亚型的模式和动力学略有不同，pwCTLA-4-HBc能够引起Th1/Th2 相对平衡的应答，并且在再次加强免疫后能保持这一平衡状态，而且能够较快诱导出较强的抗体应答；5种质粒免疫后小鼠脾淋巴细胞经核心抗原CTL表位肽刺激的IFN-γ分泌细胞形成的斑点数显著多于Mock免疫的对照组，其中pwCTLA-4-HBc和pHcex免疫组显著多于其它3组。3．尾静脉高压水注射体内转染pAAV/HBV1.2，经pwCTLA-4-HBc和pHcex免疫的小鼠，能较快清除循环中的表面抗原，在体内转染后第5天外周血中的HBV DNA水平较对照组显著降低。经核心抗原CTL表位肽刺激的IFN-γ分泌细胞形成的斑点数DNA免疫组显著多于Mock组；针对核心抗原的Th1/ Th2 型、总IgG抗体反应DNA免疫组比Mock组高；pwCTLA4-HBc免疫组Th2 型抗体反应高于pHcex免疫组，但Th1型抗体反应前者低于后者；针对表面抗原的Th1型和总IgG抗体反应：无统计学差异，Th2 型抗体反应：2个DNA免疫组都比Mock组抗体滴度高，pwCTLA4-HBc免疫组高于pHcex免疫组。
　　 结论：1．成功构建真核表达质粒pwCTLA-4-HBc、pmCD27-HBc和pmCD40L-HBc。2．以上构建的3种质粒与对照质粒pHcex和pHeex 电击免疫小鼠，能够在小鼠体内诱导体液和细胞免疫应答，其中pwCTLA-4-HBc和pHcex的应答最强。3．pwCTLA-4-HBc和pHcex 电击免疫能够部分抑制体内转染的pAAV/HBV1.2在小鼠体内的复制，较快清除抗原，细胞免疫和体液免疫可能都参与了这一过程。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：图表目录

声明

前 言

第一部分HBcAg 融合蛋白真核表达质粒的构建

第二部分HBcAg 融合蛋白DNA 疫苗免疫效应的研究

第三部分HBcAg 融合蛋白DNA 疫苗保护效力的研究

参 考 文 献

综 述

致 谢