P21亚细胞定位改变对HepG2细胞增殖和凋亡的影响

摘要

第一部分，目的：构建野生及胞浆定位突变型P21基因的真核表达载体，为研究P21亚细胞定位改变对HepG2细胞周期及凋亡的影响奠定基础。
　　 方法：以含人全长的p21cDNA 质粒为模板，采用大引物PCR 定点诱变技术，扩增野生及核定位信号突变型P21基因，TA 克隆到pMD18-T 载体中，将它们用BamHⅠ
　　 和ECoRⅠ双酶切后，以正确读码框插入到经同样酶切的真核表达载体pDsRed1-C1载体中，获得真核表达质粒pDsRed1-C1-P21WT、pDsRed1-C1-P21MT。以PCR和酶切方法筛选鉴定阳性重组质粒并测序验证。
　　 结果：构建的野生及胞浆定位突变型P21基因的真核表达载体经酶切鉴定和DNA测序，表明各基因正确地插入到真核表达载体pDsRed1-C1中，且密码子阅读框正确。
　　 结论：成功地构建了构建的野生及胞浆定位突变型P21基因的真核表达载体。
　　 第二部分，目的：观察构建的野生及突变型P21真核表达质粒亚细胞定位，P21mRNA表达水平，检测P21真核表达质粒对HepG2细胞周期及凋亡的影响。
　　 方法：利用脂质体将P21真核表达质粒转染HepG2细胞，经G418 筛选获得稳定转染P21的细胞株。荧光显微镜观察P21在细胞内的亚细胞定位及分布；RT-PCR 检测P21mRNA的表达情况；MTT 实验检测P21亚细胞定位的改变对细胞增殖影响；
　　 经放线菌素-D（Act-D：1mg/L）凋亡诱导24h后，Annexin V-FITC/PI 双染流式细胞术检测细胞凋亡率；流式细胞仪检测细胞周期改变。
　　 结果：荧光显微镜观察提示：稳定转染的细胞株，野生型组、突变型组P21融合蛋白呈团块状聚集，野生型组其荧光主要定位于细胞核，而核定位信号突变型组荧光主要定位于胞质。RT-PCR 检测提示：野生型组、突变型组细胞株其细胞内均有P21mRNA 高丰度的表达；MTT 实验提示：突变型组细胞增殖加快，表现为曲线左移、斜率变陡（P<0.01）；野生型组细胞增殖减慢，表现为曲线右移、斜率变平（P<0.01）；
　　 各组细胞周期分析表明：野生型组HepG2细胞与突变型组相比，G0/G1细胞比例明显增加（P<0.01）；流式细胞术检测细胞凋亡率提示：突变型组：1.24；野生型组：8.45，凋亡率差异显著（P<0.01）。
　　 结论：野生型P21定位于细胞核，核定性信号突变型型P21定位于细胞浆，胞浆型P21促进HepG2细胞增殖、促进细胞周期运行、增强其抗凋亡能力。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:英文缩写词及中文对照

声明

前言

第一部分野生及胞浆定位突变型P21基因真核表达质粒的构建

第二部分P21真核表达质粒体外对HepG2细胞增殖及凋亡的影响

总结与展望

综述胞浆P21蛋白表达的研究进展

附录攻读博士学位期间完成的论文

致谢