雌激素对心肌L型钙通道及钠钙交换体的调控作用及其机制研究

摘要

目的：长QT综合征（Long QT Syndromes，LQTs）是由基因突变或药物等因素延长心肌细胞复极所致的临床综合征，易诱发尖端扭转性室性心动过速（torsade de pointes，TdP），导致发作性晕厥、甚至心脏猝死。成年女性患者更易发生致死性的TdP。然而在幼年时，体内性激素显著增高前（男孩<14岁，雄兔<42日龄），雄性发生TdP的风险明显高于相应的雌性个体，这一心律失常表型的性别差异在青春期之后发生逆转。已有研究提示，雌激素是影响TdP易感性的重要因素。L型钙通道（L type calcium channel，Ca-L）功能上调可能与LQTs时心律失常易感性在成年后的逆转及EAD发生率的性别差异有关。钠钙交换体（sodium calcium exchanger，NCX）亦可能在其中发挥一定作用。在本研究中，我们观察性别、年龄和心肌部位诸因素对NCX表达的影响，并探讨雌激素调控Ca-L及NCX功能的作用及其作用机制。
　　 方法：（1）采用主动脉逆流灌注和消化酶解方法，获得单个家兔心室肌细胞。根据实验需要，用雌激素等不同药物孵育心肌细胞。采用全细胞膜片钳技术在电压钳模式下记录Ica-L，免疫组化法分析Cav1.2α蛋白表达水平，单细胞实时定量RT-PCR检测Cav1.2αmRNA表达，以探讨雌激素对Ca-L功能的调控作用及其作用机制。在电流钳模式下记录动作电位，并以多非利特诱发EAD，以研究雌激素对LQTs时心律失常易感性的影响。（2）如（1）方法分离幼年及成年家兔心室肌细胞，采用全细胞膜片钳技术在电压钳模式下记录钠钙交换电流（Sodium calcium exchanger current，INCX）。收集幼年及成年家兔心肌组织，采用western-blot方法分析NCX蛋白表达。在Langendorff灌流的家兔心脏上，采用同步光学标测膜电位及细胞内钙，利用NCX抑制剂KB-R7943，评估NCX对E4031致心律失常作用的影响。（3）如（1）方法获得单个家兔心室肌细胞。根据实验需要，采用雌激素等不同药物孵育心肌细胞。采用全细胞膜片钳技术在电压钳模式下记录INCX，免疫组化法分析NCX1蛋白表达水平，以探讨雌激素对NCX功能的调控作用及其作用机制。雌激素或DMSO孵育24 h后，在电流钳模式下记录动作电位，并以多非利特诱发EAD，利用NCX抑制剂KB-R7943，以评估NCX对雌激素增加LQTs时心律失常易感性作用的影响。
　　 结果：（1）与对照组相比，雌激素孵育24 h后心底部心外膜下心肌细胞Ica-L显著增加（p<0.05），但雌激素并未改变Ica-L I-V曲线的形状；孵育48 h和72 h后，雌激素进一步增加Ica-L 电流密度（p<0.01），但并不改变Ca-L的通道门控。生理浓度范围内的雌激素（0.1~1 nM）可浓度依赖性的增加心外膜下心肌细胞Ica-L，而孕激素无此作用。雌激素可受体依赖性的上调Ica-L，其作用主要由雌激素受体α介导。雌激素孵育24 h后Cav1.2α的mRNA表达和蛋白表达水平均明显增加。雌激素与转录抑制剂放线菌素D（actinomycin D，AD）和翻译抑制剂放线菌酮（cyclohexmide，HX）共同孵育后，雌激素上调Ica-L的作用被抑制。雌激素孵育24 h后，多非利特诱发心肌细胞发生EAD的风险增加，且此作用具有雌激素受体依赖性。（2）成年雄兔心底部（1.76±0.27 pA/pF），心尖部（1.70±0.30 pA/pF）以及雌兔心尖部（1.30±0.50 pA/pF）INCX的电流密度相似，但雌兔心底部INCX的电流密度（2.59±0.32 pA/pF）明显升高，与雄兔心底部及两种性别家兔心尖部INCX的电流密度相比有统计学差异（p<0.05）。雌性幼兔心底部（1.21±0.25pA/pF）和心尖部（1.28±0.28pA/pF）INCX的电流密度相似（p=0.84），而雄兔心底部INCX的电流密度（3.96±0.35pA/pF）明显升高，与雄兔心尖部（2.61±0.43 pA/pF）以及雌兔心尖部和心底部INCX的电流密度相比均有统计学差异（p<0.05）。雄性幼兔心底部NCX1的表达较心尖部增高44％（p<0.05），较雌兔心尖部NCX1表达增高52％（p<0.05），较雌兔心底部NCX1表达增高64％（p<0.01）；而成年雌兔心底部NCX1的表达较雌兔心尖部和雄兔心肌组织的NCX1表达均高38％（p<0.01）。在成年雌兔或雄性幼兔心肌中，Ikr抑制剂E4031（0.5μM）灌流后可诱发EAD和TdP，然后在灌流液中加入KB-R7943 (1 μM)，继续灌流10 min后可抑制E4031诱发的EAD和TdP。（3）培养（不含雌激素）雌兔心底部和心尖部心外膜下心肌细胞，在细胞分离后2~5h（Day 0）、第1天（Day 1）、第2天（Day 2）和第3天（Day 3）记录INCX，在Day 0时，雌兔心底部INCX电流密度明显高于心尖部，从Day 1到Day 3，心底部INCX电流密度逐日减小，到Day 2和Day 3心底部和心尖部INCX电流密度的差异消失；而来自同一心脏的心尖部INCX电流密度无明显变化。雌激素（1 nM）孵育24 h亦可增加雌兔心底部心肌细胞NCX1蛋白的表达，但对心尖部NCX1蛋白的表达无明显影响。雌激素（1 nM）孵育24~72 h后，雌兔心底部心肌细胞INCX电流密度明显增加，但不影响心尖部心肌细胞INCX电流密度，对雌兔心底部心内膜下心肌细胞及雄兔心底部心外膜下心肌细胞INCX也没有影响。雌激素上调INCX的作用系经雌激素受体介导。转录抑制剂放线菌素D（actinomycin D，AD）和翻译抑制剂放线菌酮（cyclohexmide，CX）可抑制雌激素上调INCX的作用。雌激素孵育24 h后，多非利特诱发心肌细胞发生EAD的风险增加，NCX抑制剂KB-R7943可抑制多非利特诱发的EAD。
　　 结论：性别、年龄及心肌部位等因素可影响家兔心脏INCX密度及NCX蛋白分布，其分布特点与Ca-L类似，NCX功能的性别差异影响了心律失常易感性的性别差异。雌激素可性别依赖性及部位依赖性的上调家兔心肌Ca-L及NCX的功能，此作用由雌激素受体介导，经由基因组作用调控Ca-L及NCX的功能。雌激素上调家兔心肌Ca-L及NCX的功能，可增加家兔心肌多非利特诱发EAD的易感性，是LQTs时TdP风险性别差异的重要影响因素。

目录

文摘

英文文摘

论文说明;英文缩略词表

声明

前 言

第一部分 雌激素对L型钙通道的调控作用

第二部分 心肌钠钙交换体分布的性别、年龄和部位差异

第三部分 雌激素对钠钙交换体的调控作用

全文总结

本研究有以下创新之处：

综述：性激素和长QT综合征心律失常的性别差异

工作小结

致 谢