LRIG1抑制EGFR入核增强顺铂对T24膀胱癌细胞损伤的研究

摘要

背景及目的:膀胱肿瘤患者近70％为表浅性，即非肌层浸润性，多数患者能通过经尿道膀胱肿瘤电切术等局部治疗手段控制病情。余下的20-30％常伴有膀胱肌层侵犯，其中晚期患者常需要联合全身化疗才能控制病情，提高患者的生存率。顺铂是治疗晚期侵袭性膀胱肿瘤的常用化疗药物，属于引起DNA损伤的药物之一。尽管顺铂有一定的疗效，但由于药物部分或完全耐受，仅有15％的晚期膀胱癌患者获得完全缓解。最近的研究表明，多种引起DNA损伤的治疗能导致表皮生长因子受体（EGFR）入核，并引起DNA的损伤修复。因此，抑制EGFR 入核可能起到增强顺铂DNA损伤的能力，从而提高顺铂的疗效。目前，抑制EGFR 入核的方法主要有抑制EGFR的激活以及抑制EGFR 酪氨酸激酶的活性两种途径。但目前尚无对抑制EGFR 入核诱导增强顺铂对膀胱肿瘤疗效方面的研究。富含亮氨酸重复序列及免疫球蛋白样结构域1（LRIG1）是EGFR的天然配体之一。其在膀胱肿瘤组织中表达缺失或者完全不表达。前期研究发现，在表浅性膀胱癌细胞系BIU-87中上调LRIG1的表达水平能够抑制肿瘤细胞的增殖，降低肿瘤细胞转移及侵袭的能力。上述研究结果使假设，是否能通过LRIG1 抑制EGFR的活性，影响pEGFR的入核水平，增敏顺铂的疗效。
　　 设计这个实验目的在于，通过顺铂作用膀胱癌细胞系T24，研究其是否能导致DNA损伤后EGFR入核。在联合LRIG1转染后，观察pEGFR入核是否能受到抑制，LRIG1是否能藉此增强顺铂诱导DNA损伤的能力。
　　 方法:采用顺铂分别处理T24膀胱肿瘤细胞10，20和30分钟，提取各组蛋白的核蛋白及总蛋白。免疫印迹法检测细胞核蛋白内pEGFR的水平和总蛋白中EGFR的水平。而后采用腺病毒载体包装LRIG1基因转染T24细胞，并采用顺铂处理30分钟后再次检测pEGFR和EGFR表达水平，观察LRIG1是否能抑制顺铂诱导的EGFR入核。另外为了研究这种现象的机制，我们采用蛋白酶体抑制剂MG132预处理T24细胞后再转染LRIG1，目的在于观察LRIG1是否通过EGFR-蛋白酶体通路影响EGFR以及pEGFR的表达水平。
　　 最后，分别采用单细胞凝胶电泳检测肿瘤细胞DNA损伤程度，荧光流式细胞分选术检测肿瘤细胞周期以及细胞早期及晚期凋亡水平，免疫细胞化学法检测肿瘤细胞增殖细胞核抗原（PCNA）的表达水平，Transwell小室法检测肿瘤细胞的侵袭能力等。目的在于，观察LRIG1抑制EGFR入核后，顺铂对DNA的损伤能力是否增强。
　　 结果:在经过顺铂诱导10，20和30分钟后，T24膀胱肿瘤细胞核内的pEGFR表达水平明显升高，但EGFR的整体表达水平无显著变化。腺病毒载体成功包装LRIG1基因后，将其转染T24膀胱肿瘤细胞，再使用顺铂处理转染后的细胞及对照组细胞，检测其核内pEGFR表达水平及EGFR总量，观察LRIG1是否能抑制EGFR入核。结果显示，在转染了LRIG1后，核内pEGFR的表达水平显著下降，此外，EGFR的表达水平也显著降低。此后，我们采用蛋白酶体抑制剂MG132，抑制在EGFR降解过程中的关键酶体26S，观察LRIG1是否通过降解EGFR抑制pEGFR入核。可见MG132处理后，LRIG1不能抑制EGFR降解，同时核内pEGFR的水平也维持在较高的水平。在LRIG1联合顺铂处理T24细胞后，我们发现，单细胞凝胶电泳实验中肿瘤细胞的OTM值显著升高；细胞周期被抑制在S期；细胞早期和晚期的凋亡水平明显升高；细胞PCNA的染色比例升高，但细胞增殖能力下降；细胞穿过Transwell小室的个数明显减少，侵袭能力降低。
　　 结论:实验证明，顺铂诱导的EGFR入核能被LRIG1过表达所抑制，该过程涉及EGFR的降解及EGFR磷酸化水平的改变。使用LRIG1联合顺铂能有效提高细胞DNA的损伤程度，可能成为增敏顺铂疗效的一种新的治疗手段。

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文摘

英文文摘

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声明

引 言

第一部分 LRIG1质粒的提取及Ad-LRIG1腺病毒载体的构建

第二部分 LRIG1抑制顺铂诱导T24膀胱癌细胞EGFR入核及其机制的研究

第三部分 LRIG1增强顺铂对T24膀胱癌细胞的损伤作用

全文结论

参考文献

综述 靶向治疗在恶性肿瘤化疗中对顺铂增敏作用的研究进展

附录

致 谢