HCN4编码的If在胚胎心室起搏活动中的非必要性

摘要

第一部分
　　 目的：自超极化激活内向电流被发现以来，其特性就被广为研究。但因其作用表现和表达分布的复杂多样性，其在心脏起搏活动中的确切作用一直存在争议。本研究拟从电生理学方面明确超极化激活内向离子通道在早期胚胎心肌细胞上所起的作用。
　　 方法：1.观察If阻断剂对If，ICaL和ICaT电流的影响方法：采用胶原酶B消化获得单个小鼠胚胎心肌细胞并培养24-36小时。选择跳动的单个细胞,细胞为E10.5天心肌细胞，1mMCs+离子作为阻断剂，以全细胞电压钳模式记录心肌细胞的If，ICaL和ICaT电流表达。结果：1mM Cs+显著抑制If (减少93.1±1.7％，n=13，p<0.05)，冲洗后能完全恢复。与此同时，Cs+仅轻度升高L型钙电流(至15.5±4.12％,n=11，p<0.05)。对T型钙电流基本无影响(n=11，p>0.05)。这表明相对L型钙电流和T型钙电流而言，Cs+对If通道存在相对特异阻断性。因此我们在后续实验中采用Cs+作为If通道阻断剂来观察各项目。2.If在E9.5-E10.5起搏样细胞(P-like)起搏活动中所起的作用方法：采用胶原酶B消化分离以获得单个小鼠胚胎心肌细胞，培养24-36小时后，选择E9.5和E10.5起搏样细胞(P-like)进行研究，应用全细胞电流钳模式以记录目的：自超极化激活内向电流被发现以来，其特性就被广为研究。但因其作用表现和表达分布的复杂多样性，其在心脏起搏活动中的确切作用一直存在争议。本研究拟从电生理学方面明确超极化激活内向离子通道在早期胚胎心肌细胞上所起的作用。
　　 结果：1.观察If阻断剂对If，ICaL和ICaT电流的影响方法：采用胶原酶B消化获得单个小鼠胚胎心肌细胞并培养24-36小时。选择跳动的单个细胞,细胞为E10.5天心肌细胞，1mMCs+离子作为阻断剂，以全细胞电压钳模式记录心肌细胞的If，ICaL和ICaT电流表达。结果：1mM Cs+显著抑制If (减少93.1±1.7％，n=13，p<0.05)，冲洗后能完全恢复。与此同时，Cs+仅轻度升高L型钙电流(至15.5±4.12％，n=11，p<0.05)。对T型钙电流基本无影响(n=11，p>0.05)。这表明相对L型钙电流和T型钙电流而言，Cs+对If通道存在相对特异阻断性。因此我们在后续实验中采用Cs+作为If 通道阻断剂来观察各项目。2.If在E9.5-E10.5起搏样细胞(P-like)起搏活动中所起的作用方法：采用胶原酶B消化分离以获得单个小鼠胚胎心肌细胞，培养24-36小时后，选择E9.5和E10.5起搏样细胞(P-like)进行研究，应用全细胞电流钳模式以记录结果表明，在E10.5的心室肌细胞上，动作电位的产生和If 并无直接联系。
　　 结论：1.在胚胎发育过程中，超极化激活内向电流能稳定持续参与心脏起搏样细胞的起搏活动。2.在胚胎发育过程中，胚胎心室起搏活动与超极化激活内向电流之间并无必然联系。
　　 第二部分
　　 目的：为明确超极化激活内向离子通道作用表现和表达分布的复杂多样性与其亚型表达之间的关系，本研究拟从分子生物学方面明确超极化激活内向离子通道的亚型与其在早期胚胎心肌细胞上所起的作用之间的关系。
　　 方法：1.HCN亚型表达的发育性变化方法：采用RT-PCR技术，比较在早期胚胎发育过程中，从E8.5至E10.5，小鼠胚胎心室肌组织HCN2和HCN4 亚型在mRNA水平的表达。结果：早期胚胎发育期中，Cs+对心室细胞起搏活动影响的变化可能归根于基因表达的差异，因此我们检测了HCN2和HCN4亚型在mRNA水平的表达。在胚胎发育过程中，HCN4表达下调而HCN2表达上调。从E8.5至E10.5，HCN4均为心脏的HCN主要表达亚型。虽然HCN2和HCN4改变量并不显著 (p>0.05)，但已表现出逐步变化的趋势。2.敲除HCN4 对E10.5的心室肌细胞的动作电位和4期自动除极速率的影响方法：采用小干扰核糖核酸技术(siRNA)以观察敲除HCN4基因后对E10.5心室样细胞的影响。
　　 结果：为了观察HCN4亚型在E10.5心室肌细胞上的具体功能，我们应用小干扰核糖核酸技术(SiRNA)来敲除HCN4亚型。在敲除组，仅有20％的心室肌细胞检测到If 电流，而且If的电流密度从26.0±2.7 pA/pF（对照组，n=8）降低至5.6±1.8 pA/pF (n=10)(p<0.01，对照组：敲除组)。然而，心室肌细胞的动作电位和4期自动除极速率均未改变(p>0.05)。以上结果表明，尽管HCN4在E10.5的心室肌细胞的mRNA水平显著表达，但HCN4所编码的If在胚胎心室肌细胞的起搏活动中所起作用有限。
　　 结论：1.HCN4确实是早期胚胎心脏上超极化激活阳离子通道的主要表型。2.超极化激活内向电流的作用除了mRNA表达水平影响以外，可能更重要受到具体亚型功能表达的影响。3.胚胎心室起搏活动不依赖于HCN4编码的If。

目录

声明

绪论

第一部分 超极化激活内向离子通道(If)在早期胚胎心肌细胞上的电生理学作用

第二部分 超极化激活内向离子通道(If)在早期胚胎心肌细胞上的分子水平研究

全文总结

综述:超极化激活内向电流（If）的生理学和药理学特性

附 录

致 谢