神经酰胺代谢酶抑制剂对其含量的影响及鞘磷脂酶在双氧化酶1激活中的作用

摘要

随着科技的发展,鞘脂从最初的被认为仅具有形成细胞膜结构的功能,到现在被证实是具有广泛生理活性的中介物,参与着细胞内各种信号传递和转导。而细胞内鞘脂代谢的中心分子神经酰胺,也越来越受到科学家们的关注。神经酰胺是细胞内重要的第二信使,近年来,关于神经酰胺在各种疾病中的研究急剧增多。
　　神经酰胺可由酸性鞘磷脂酶(ASMase)水解鞘磷脂产生,同时,也可被神经酰胺酶分解为鞘氨醇、在鞘磷脂合成酶的作用下转化生成鞘磷脂;在细胞内,神经酰胺与鞘磷脂和鞘氨醇存在动态平衡的关系,其中一种物质的生成直接或间接影响另外两种物质的水平。脂筏是一种位于细胞膜上的单位体,它是一些富含胆固醇和鞘脂的微区域,像小筏一般漂浮于流动的细胞膜中,故称之为“脂筏”。当细胞受到某种刺激时,脂筏被鞘磷脂酶激活并释放出大量由鞘磷脂水解而来的神经酰胺,神经酰胺由于氢键作用相互联接形成微区,微区之间又可以迅速连接,形成一个或几个平台区。这些富含神经酰胺的脂筏平台区广泛地参与胞内各种信号转导及蛋白质转运。
　　近期研究发现,动脉粥样硬化(AS)的发生与脂质代谢异常特别是鞘磷脂、神经酰胺的异常密切相关,气道炎症如支气管哮喘的发生也与脂筏通路的激活息息相关。基于此,本研究拟观察,在给予神经酰胺干扰剂后,神经酰胺的水平是否发生变化,为下一步观察低密度脂蛋白(LDL)和氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)在血管内皮细胞中的穿胞(transcytosis)是否随着神经酰胺含量的变化而发生改变奠定检测学的基础。另外,我们还通过转染特异性siRNA进入细胞,特异性抑制气道上皮细胞中与炎性反应密切相关的双重氧化酶(Duox1)和与脂筏激活、神经酰胺产生相关联的酸性鞘磷脂酶的蛋白表达,观察活性氧生成量的变化和核转录因子 NF–κB活性的改变,来观察Duox1的活化是否依赖于脂筏-神经酰胺通路的激活。
　　这些研究有助于我们更多地了解脂筏-神经酰胺通路在细胞分子水平中的各种作用及机制。
　　文章从以下两部分就神经酰胺代谢酶抑制剂对其含量的影响及鞘磷脂酶在双氧化酶1激活中的作用进行了综述。
　　第一部分神经酰胺代谢酶抑制剂对其含量的影响
　　目的:观察神经酰胺干扰剂 Myriocin、D609、NOE和L-carnitine对人脐静脉内皮细胞中神经酰胺含量的影响。
　　材料和方法:1、培养人脐静脉内皮细胞,利用细胞计数试剂盒(Cell counting kit-8, CCK-8),测定不同处理组的人脐静脉内皮细胞活性;2、提取脂质,利用高效液相色谱-质谱联用方法(HPLC-MS/MS)检测不同处理组的人脐静脉内皮细胞中神经酰胺水平的变化。
　　结果:1.根据 CCK-8试验结果选择对细胞基础生理活性无明显影响的药物浓度Myriocin(30μmol/L)、D609(30μmol/L)和NOE(10μmol/L)、L-carnitine(5mmol/L)来进行实验,以期各种药物对相应酶的活性达到最佳抑制效果而对细胞的正常生理活性无明显影响。2、HPLC-MS/MS结果发现,在上述药物浓度下,神经酰胺从头合成抑制剂 Myriocin使细胞内神经酰胺含量明显减少(P<0.05);而神经酰胺酶抑制剂 NOE和鞘磷脂合成酶抑制剂 D609均使细胞内神经酰胺含量明显增加(P<0.05);而酸性鞘磷脂酶抑制剂 L-carnitine使细胞内神经酰胺含量明显增加(P<0.05)。
　　结论:建立了细胞内神经酰胺含量测定的高效液相色谱-质谱测定法,研究了神经酰胺代谢酶抑制剂对细胞内神经酰胺含量的影响,为进一步研究神经酰胺代谢酶抑制剂的药理作用打下基础。
　　第二部分鞘磷脂酶在双氧化酶激活中作用
　　目的:双氧化酶Duox1是气道上皮细胞中NADPH氧化酶(NADPH oxidase,Nox)的主要亚型,在氧分子的参与下,能够直接催化其底物产生过氧化氢,引起细胞生理和病理反应。由于脂筏来源的神经酰胺在Nox的激活中发挥十分关键的作用,本实验通过干扰脂筏-神经酰胺转化的关键酶,酸性鞘磷脂酶,来观察和探讨 Duox1的激活是否也依赖于脂筏来源的神经酰胺。
　　方法:设计合成ASM酶和Duox1特异性小干扰RNA(siRNA)。利用脂质体转染方法将ASM酶或Duox1特异性小干扰RNA转染入细胞内,观察ASM酶或Duox1蛋白被抑制后活性氧的生成变化,并检测促炎核转录因子-κB(NF-κB)的活性。结果:活性氧的产生及NF–κB的激活能被ASM或Duox1特异性siRNA所抑制。结论:气道上皮细胞中Duox1介导的一系列生理病理反应依赖于ASM酶激活产生的脂筏来源的神经酰胺。

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中文摘要

英文摘要

第一部分 神经酰胺代谢酶抑制剂对其细胞内含量的影响

前 言

材料和方法

一. 材料

二.主要仪器

三. 主要溶液配制

三.实验步骤：

结 果

1 .不同浓度的Myriocin、D609、NOE和L-carnitine对人脐静脉内皮细胞活性的影响：

2 .使用神经酰胺通路抑制剂 Myriocin、D609、NOE和L-carnitine刺激人脐静脉内皮细胞后，HPLC-MS/MS方法检测各组细胞中神经酰胺的含量：

讨 论

结 论

1. 本实验成功建立了测量人脐静脉细胞内神经酰胺总量的高效液相色谱/质谱（HPLC-MS/MS）方法。

2. 神经酰胺通路抑制剂对神经酰胺的代谢途径有明显的影响，但个别通路的抑制剂抑制神经酰胺的作用及机制有待进一步确证和研究。

第二部分 鞘磷脂酶在双氧化酶激活中的作用

前 言

材料和方法

一. 试剂

二. 主要仪器

三. Duox1、ASMase特异性小干扰RNA的设计与合成：

四. 实验步骤：

结 果

1、Duox1、ASMase特异性siRNA对气道上皮细胞Duox1、ASMase蛋白表达量的影响：

2、Duox1、ASMase 特异性 siRNA 对刺激条件下气道上皮细胞中活性氧生成的影响：

3、Duox1、ASMase特异性siRNA对刺激条件下气道上皮细胞中NF-κB转录活性的影响：

结 论

参考文献

综述

1. 质谱用于生物样本中鞘脂类分析的方法：

2. HPLC-MS/MS方法：

3. 其他检测鞘脂类物质的方法：

参考文献

攻读硕士学位期间科研成果

致谢