饮用水中病毒浓缩及检测方法的研究和应用

摘要

由人粪便排入环境中的病毒已达140多种血清型,可导致胃肠炎、肝炎、发热、脑膜炎、心肌炎等疾病,严重威胁到人类健康。这些病毒在胃肠道复制,主要通过粪口途径传播,是导致水源性疾病的一个重要原因。近年来屡见饮水受到肠病毒污染引起肠道传染病爆发的报道。饮用水安全与人们的生产生活息息相关,其病毒学安全性应该引起学界与有关管理部门高度重视。
　　许多国家都采用粪便污染指示菌来评价水体的卫生微生物学质量包括病毒污染状况。研究发现水环境的细菌学水平和病毒浓度之间无明显相关,同时病毒对外界环境和消毒作用的抵抗力更强,在满足水体细菌学卫生标准的情况下仍能检测到病毒。因此目前各国普遍采用的指示菌不能准确反映水中病毒学安全性。直接对病毒进行检测可以提供更可靠的水体病毒污染信息,进一步确保用水安全。但是,迄今国内外尚未制定饮水病毒学标准和统一可行的水中病毒学检测方法,根本原因在于其技术难度高、费用昂贵、工作量大,涉入门槛高,基础科研数据积累少。严重制约了饮用水病毒学研究在国内的开展。因此,本研究将从新材料、新配方、新的分子生物学检测法多角度,探索建立可靠、有效的饮用水中病毒浓缩、检测方法,并在制水生产实践中检验诸方法应用效果。
　　仅就技术而言,首先环境水体中病毒浓度远比临床病人感染样本低,如果特指可能存在于饮用水中的病毒,两者相差最大可达1017数量级。采用最灵敏的临床检测方法也无法对饮水中病毒进行检测。因此,欲开展饮用水病毒学研究,必须面对水中病毒浓缩技术与设备的挑战。目前浓缩水中病毒的方法有:微孔滤膜吸附法、硅藻土吸附法、氢氧化铝吸附沉淀法等。但因为材质和材料物理化学性质、洗脱液性质、操作流程不同,导致各种浓集方法最终结果相差悬殊,使不同国家与地区结果缺乏可比性,难以统一,因此迫切需要探索建立一种高效、灵敏和简捷的浓缩方法。本研究在此方面进行了初步尝试,对比了国产微孔滤膜与进口NanoCeram滤芯初次浓缩病毒的效率。NanoCeram滤芯是一种新型的正电滤芯,因此国外相关实际应用的报道也相对较少。滤芯的表面积大500至600m2/g,能够对不同浊度的大体积水样进行有效浓缩,不需调节水样的pH等处理,可直接进行浓缩,操作过程简单,且价格仅为1MDS滤芯的1/5。本研究首次在国内将此滤芯应用于实际水样病毒的浓缩,所获实验数据为国内今后利用该滤芯提供了良好的参考依据。
　　研究水中病毒的第二个技术难点在于,操作步骤繁杂,第一次浓缩后并不能直接检验病毒,必须再进行第二次浓缩,使其最终体积缩小到类似于临床标本体积。第二次浓缩方法有,絮凝沉淀、透析、超速离心等,由于待浓缩样本体积仍然较大,后两种方法不太实用,主要采用絮凝沉淀法。絮凝剂有无机絮凝剂和有机絮凝剂,种类繁多,理化性质各异,寻找理想满意的絮凝剂,需要具体问题具体分析,开展细致筛选研究。本研究探讨了3种不同絮凝剂在二次浓缩中的最佳条件与效果,有机絮凝剂聚乙二醇择优而出。
　　浓缩过程结束,仅仅类似于完成了临床标本的采集,随之相应的除菌、选择敏感宿主接种样本,观察病毒复制接踵而至。但是,环境中病毒与临床检验巨大不同处是其多样性,一个患者一般情况下只感染一种病毒,其实验室敏感宿主细胞范围较窄,容易确定。可是,环境水体中浓缩的病毒,可能为一种,也可能有多种数十种,不同病毒有其特定的敏感宿主,这为最终检测环境病毒带来极大的工作量。另外,有的病毒不能用细胞检测,例如,诺如病毒,或有些病毒对细胞不敏感,例如,腺病毒 F组40、41血清型,这为检测环境病毒带来极大不确定性。若要解决以上问题,只能从分子生物学领域借助工具,基因探针和聚合酶链反应(PCR)似乎能够同时解决以上难题,但是基因探针因其灵敏度太低,已被淘汰,而最新的荧光定量PCR(qPCR)技术视乎可弥补上述所有不足。荧光定量PCR可对模板进行实时监测,精确对起始模板进行定量,且检测时间短,从病毒核酸提取到荧光定量PCR完成仅仅需要4～5小时,荧光定量PCR检测范围宽,灵敏度高,特异性强,显示其在环境病毒学检测中的巨大优势。尽管如此,对于具体的每一种病毒,qPCR技术并非唾手可得,针对不同病毒,其保守区引物设计,内标构建,扩增产物特异性、检测方法的灵敏度等,都需要探索研究。本研究针对不易培养的腺病毒 F组40、41血清型、培养难度较大的A群轮状病毒及具有普遍意义的整个肠道病毒属,构建了相应的荧光定量PCR方法,成功实现对自来水厂水样中相应病毒的检测。
　　国外研究显示病毒普遍存在于各种水体,例如江、河、湖、海、地下水,乃至经过净化处理过的自来水都含有一定量的病毒。国内有研究人员检测了渤海中肠道病毒的污染情况,检测发现海水中肠道病毒浓度范围为6.3×107拷贝/L至1.7×106拷贝/L,何等仅仅采集了2L水样,发现轮状病毒在北京水源水中的检出率为34.6％,出厂水中的检出率为11.7％,末梢水中的检出率为22.4％。二十年前,张楚瑜等人对武汉东湖水厂肠道病毒进行检测,原水病毒浓度均值为14.31PFU/L,阳性率为60％,出厂水浓度均值为6.7PFU/L,阳性率为35％,水厂水处理工艺对肠道病毒的去除率为53.18％。当时东湖是武汉武昌区的主要饮用水水源,然而随着东湖水污染的日益加重,最后不得不放弃将其作为饮用水水源,改用长江水为唯一饮用水水源。武汉市是长江与汉江汇聚的大都市,武汉受惠于两江,但也可能遭受其害。原因在于,随着中国经济突飞猛进的发展,长江、汉江环境污染负荷日益加重,有报道,仅2007年一年长江就接受了300多亿吨废水。武汉有关部门最新公布资料,在武汉的18各水源保护地附近就有15处污水排放口,直接威胁到自来水厂取水安全。人们有理由为自己饮水的化学安全性、生物学安全性担心。但是,有关利用长江与汉江作为水源的各自来水厂原水、出厂水是否存在病毒污染,其变化规律如何,一直是有待解开的迷。不仅如此,整个长江流域200多个大中小城市,甚至全国县以上4000多个水厂也几乎很少开展饮水病毒学研究。这种状况与国际上同类研究差距甚远,无论从学术上还是从生产实践中都需要急起直追。本研究对武汉市两江共6个自来水厂病毒污染状况开展了一年四季的监测调查,比较了出厂水与原水中腺病毒、轮状病毒和肠道病毒的污染水平与去除率,考察了粪便污染指示菌、有关重要理化指标与病毒灭活的关系,对研究结果进行了科学谨慎的评价,填补了该领域的部分空白。本研究从饮用水中病毒浓缩方法的建立与比较、荧光定量PCR检测腺病毒、轮状病毒和肠道病毒方法的建立和水厂原水和出厂水中腺病毒、轮状病毒、肠道病毒的测定三方面进行介绍。

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中英文缩略词表

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前 言

第一部分 饮用水中病毒浓缩方法的选择

1试剂与材料

2 方法

3 结果

4 讨论

5 结论

第二部分 荧光定量PCR检测腺病毒、轮状病毒和肠道病毒方法的建立

1试剂与材料

2 方法

3结果

4讨论

5结论

第三部分 水厂原水和出厂水中腺病毒、肠道病毒、轮状病毒的测定

1试剂与材料

2方法

3结果

4讨论

5结论

总 结

参考文献

综述

一水环境病毒概况

二环境病毒检测概况

二PCR技术对病毒核酸的检测

三PCR技术对病毒感染性的检测

四总结

参考文献

附录1

致谢