Notch1对子宫内膜异位症内膜干细胞增殖分化的调控

摘要

目的:
　　1.从人子宫在位内膜中分离培养子宫内膜间质细胞和腺上皮细胞,运用平板克隆形成法纯化子宫内膜间质干细胞和腺上皮干细胞,并通过干细胞标志物的表达来鉴定干细胞。
　　2.构建 Notch1慢病毒表达载体(Notch1-shRNA),并提取病毒上清。
　　3.体外研究 Notch1-shRNA干预子宫内膜间质干细胞和腺上皮干细胞后,两种子宫内膜干细胞的干细胞活性和分化标志物的变化及其迁移和侵袭能力的变化。
　　方法:
　　1.在位子宫内膜腺上皮细胞和间质细胞的原代培养,并运用平板克隆形成实验纯化子宫内膜干细胞。采用real time PCR和western blot法分别检测上皮细胞标志物EMA、CK、CD49f和间质细胞标志物THY-1(CD90)、collagen type I、5B5、vimentin在子宫内膜腺上皮干细胞和间质干细胞的表达。
　　2.构建Lentivirus(LV)-靶向Notch1基因-shRNA载体并获取病毒上清,测定病毒滴度。
　　3.观察LV-Notch1-shRNA对人子宫内膜干细胞的干细胞活性和分化标志物的影响及对人子宫内膜干细胞迁移和侵袭能力的影响:运用课题组前期建立的技术原代培养人异位内膜细胞,immunohistochemistry(IHC)鉴定,运用平板克隆形成法纯化子宫内膜干细胞。将重组慢病毒在体外感染纯化获得的内膜干细胞,分别以空载慢病毒感染的内膜干细胞作为阴性对照。采用real time PCR法分别检测各组内膜干细胞中BMI1、CD133、Oct4、Sox2和Nanog mRNA表达的变化,用平板克隆形成实验检测干细胞的克隆形成能力,transwell小室测定内膜干细胞侵袭能力。
　　结果:
　　1.原代培养子宫内膜细胞经免疫细胞化学法鉴定后,光学显微镜观察:腺上皮细胞呈团状排列生长,细胞呈多角形或蝌蚪形,边界清楚,排列紧密,胞浆饱满,核圆大;间质细胞呈多角形或梭形排列,胞浆薄而透明,核椭圆。运用平板克隆形成法纯化内膜干细胞,当50个/cm2时,子宫内膜细胞克隆形成能力最强。
　　2.经阳性克隆 PCR鉴定及测序分析,结果显示合成的Notch1-ShRNA序列插入正确。经纯化浓缩后产生的慢病毒滴度为8×10TU/ml。
　　3.免疫荧光细胞化学染色可见呈红色发光颗粒,说明Notch1蛋白主要定位于子宫内膜间质干细胞和腺上皮干细胞的细胞浆和细胞核中,干扰Notch1后细胞Notch1蛋白明显减少,而空载对照未干扰Notch1的细胞株蛋白表达明显。
　　4.在子宫内膜腺上皮干细胞中与对照组比较,Notch1蛋白表达水平具有显著性差异(P<0.05)。在子宫内膜间质上皮干细胞中与对照组比较,Notch1蛋白表达具有显著性差异(P<0.05)。子宫内膜腺上皮干细胞和间质干细胞中Notch1的表达均被明显抑制,较对照组其抑制效率超过70％(P<0.05),而作为对照采用con-shRNA干扰的细胞中Notch1的表达无明显改变。
　　5.子宫内膜腺上皮干细胞和间质干细胞中采用慢病毒 Notch1-shRNA干扰后影响干细胞表型的标志物 BMI1、c-Myc、Sox2、Oct4、Nanog、CD133的表达均有不同程度的下降(P<0.05)。子宫内膜腺上皮干细胞和间质干细胞中采用慢病毒Notch1-shRNA干扰后影响细胞克隆形成率均有不同程度的下降(P<0.05)。
　　6.慢病毒干扰沉默 Nocth1基因后子宫内膜间质干细胞迁移率明显下降,24小时划痕愈合率为48％vs75％,差异具有明显意义(P<0.05);子宫内膜腺上皮干细胞迁移率明显下降,24小时划痕愈合率为48％vs78％,差异具有明显意义(P<0.01)。
　　7.采用Transwell侵袭小室测定法得出子宫内膜间质干细胞和腺上皮干细胞的侵袭能力,结果显示两种细胞的侵袭能力明显下降,24小时培养后穿过 Transwell的每低倍视野细胞数分别为33.37±3.3、46±5.4,差异具有显著性意义(P<0.05)。
　　结论:
　　1.从在位子宫内膜中分离纯化出的子宫内膜干细胞的上皮干细胞表面标志物 EMA、CK、CD49f及间质干细胞标志物 THY-1、collagen type I、5B5、vimentin在子宫内膜间质和腺上皮干细胞中表达明显高于非子宫内膜间质和腺上皮干细胞,且所鉴定蛋白的表达与 mRNA表达的结果一致。说明人子宫中存在内膜干细胞,并且与内异症的发病相关。
　　2.成功构建了LV-Notch1-shRNA,并获得了高滴度的重组慢病毒上清液。
　　3.LV-Notch1-shRNA在体外可高效地感染子宫内膜间质和腺上皮干细胞,其可在转录及翻译两个水平上高效、特异、稳定地抑制子宫内膜间质和腺上皮干细胞中Notch1基因的表达,明显抑制间质和腺上皮干细胞的克隆形成能力,明显抑制间质和腺上皮干细胞的迁移和侵袭能力,并随着时间延长,其抑制效应呈增强趋势,而空载慢病毒本身对细胞生长无明显影响。

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英文缩略词表

中文摘要

英文摘要

前 言

参考文献

第一部分 人子宫内膜异位症在位内膜细胞原代培养

一、背 景

二、实验材料和方法

三、结 果

四、讨 论

参考文献

第二部分 构建靶向Notch1基因的shRNA慢病毒载体及包装病毒

一、背 景

二、实验方法和材料

三、实验结果

四、讨 论

参考文献

第三部分 慢病毒介导shRNA抑制Notch1基因对人子宫内膜异位症子宫内膜干细胞增殖和凋亡的影响

一、背 景

二、实验材料和方法

三、结 果

四、讨 论

五、结 论

参考文献

综 述

介绍

高分子给药的载体

总结和前景

References

附 录

致谢