CD8+T细胞免疫压力下丙型肝炎病毒的适应性变异

摘要

目的：
　　1.检测武汉人群中慢性HCV感染患者基因分型,分析基因分型分布及其临床意义;
　　2.扩增HCV1b型感染患者的HCV NS3区并进行测序,分析HCV NS3功能区氨基酸变异和CD8+ T细胞表位内外的变异;
　　3.比较中国武汉人群和德国人群HLA频率分布差异。检测HCV1b型感染患者HLA分型,并比较分析武汉HCV患者人群与武汉健康人群HLA频率分布;
　　4.分析HCV1b病毒株序列变异与宿主HLA-I限制性CD8+ T细胞表位变异的相关性,并针对NS3序列预测HLA-I限制性CD8+ T细胞表位。
　　方法：
　　1.收集227例武汉慢性HCV感染患者血清和全血,抽提血清中HCV RNA,采用型特异性引物扩增法对HCV RNA进行基因分型,分析武汉人群中HCV基因型别分布,并分析HCV1b型的临床意义。
　　2.采用巢式PCR对HCV1b基因型的HCV NS3区进行扩增并测序,采用软件将HCV1b型患者的HCV NS3区序列进行序列比,分析HCV NS3功能区的变异和CD8+ T细胞表位内外的变异。
　　3.HLA频率分布网站中比较中国武汉人群和德国人群的HLA频率分布。采用型特异性引物PCR法检测中国武汉HCV1b型患者相应的HLA-I(A-和B-位点)等位基因,与武汉健康人群HLA-I等位基因频率相比较。
　　4.采用ALIGN、DNAMAN等软件分析武汉HCV1b感染患者中不同 HLA-I限制性的CD8+ T细胞表位的变异频率。采用网络软件预测HCV1b型NS3区序列的HLA-I限制性CD8+ T细胞表位。
　　结果：
　　1.227份武汉慢性丙肝患者中HCV基因1b型126例(63.6％),其他HCV基因型72例(36.4％),表明在我国慢性丙肝患者HCV主要型别是1b型。比较39例HCV1b型和19例HCV其他基因型别患者肝功能,发现HCV1b型感染者较其他HCV基因型感染者更容易出现肝功能异常,提示HCV1b型较其他HCV基因型更易造成肝脏损伤。
　　2.对30条HCV NS3区全长序列进行分析,发现决定HCV功能的氨基酸序列很难发生变异,表明HCV NS3功能区的氨基酸序列相对保守。而且HCV NS3区CD8+ T细胞表位内的氨基酸突变频率明显大于表位外(p<0.05,有统计学意义),提示CD8+ T细胞的免疫压力是导致HCV NS3变异的重要原因之一。
　　3.比较中国武汉人群和德国人群的HLA-A和HLA-B基因型频率分布,发现中国武汉人群中HLA-A02/11/24和HLA-B13/15/46频率较高。而且中国武汉和德国人群的HLA基因型频率分布有明显不同,在武汉人群中分布频率较高的HLA-A11、HLA-B46基因型频率在德国人群中明显较低;而在德国人群中分布频率较高的HLA-A01、HLA-A03、HLA-B07、HLA-B08基因型频率在中国武汉人群中较低。分析本研究中135例HCV患者的HLA-A基因型频率和134例HCV患者的HLA-B基因型频率,发现跟中国武汉健康人群的HLA基因型频率基本一致。
　　4.从群体水平上分析HCV1b型患者HLA-I限制性的HCV NS3区CD8+ T细胞表位突变,发现两个HLA-A02阳性的HCV NS3区CD8+ T细胞表位(NS31169-1177和NS31443-1451)突变频率,明显高于HLA-A02阴性的HCV NS3区CD8+ T细胞表位突变频率,有统计学意义(P<0.05)。将预测的HCV1b型患者中HLA-I限制性的HCV NS3区CD8+ T细胞表位与30条HCV NS3全长序列联合分析,发现四个预测的HCV NS3区CD8+ T细胞表位的变异与HLA-I限制性CD8+ T细胞免疫压力可能有关。
　　结论：
　　1.武汉人群中主要的HCV病毒株型别是HCV1b型,并且HCV1b型较其他HCV基因型更易造成肝脏损伤。
　　2.决定HCV功能的NS3功能区氨基酸序列很难发生变异,而HCV NS3区CD8+T细胞表位内的氨基酸突变频率明显大于CD8+ T细胞表位外的氨基酸突变频率,提示CD8+ T细胞的免疫压力是导致 HCV NS3变异的重要原因之一。
　　3.武汉和德国人群的HLA基因频率有明显不同,在武汉人群中HLA频率较高比如HLA-A11、HLA-B46在德国人群中明显较低。武汉人群中频率较高的HLA-I限制性的HCV CD8+ T细胞表位突变频率则相对较高。
　　4.两个NS3区CD8+ T细胞表位(NS31169-1177和NS31443-1451)跟HLA-A02相关,表明HCV NS3区CD8+ T细胞表位突变受到宿主HLA等位基因限制。
　　本研究的创新点：
　　1.发现武汉和德国人群的HLA基因频率有明显不同,武汉人群中频率较高的HLA-I限制性的HCV CD8+ T细胞表位突变频率相对较高,为找出最佳的HCV抗原序列并研制预防性和治疗性疫苗提供了科学基础。
　　2.国内既往多项研究集中在HCV的异质性和HCV CD8+ T细胞表位预测,仅少数研究HLA-I类等位基因与HCV变异的关系。
　　本研究的意义：
　　探讨HCV在CD8+ T细胞免疫压力下演化适应过程,测定HLA-I限制性HCV NS3区CD8+ T细胞表位序列多态性,明确不同人群中HCV在CD8+ T细胞免疫压力下演变规律,为寻找保护性CD8+ T细胞抗原表位和研制基于T细胞HCV疫苗提供科学基础。

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中英文缩写名词对照表

中文摘要

英文摘要

前 言

材料和方法

1. 材料

2. 方法

结 果

1．慢性HCV感染患者标本分析

2． HCV RNA 基因分型

3．武汉人群中HLA-I等位基因频率分布

4. HCV NS3的扩增测序和分析

讨 论

参考文献

综 述 一

1. 遗传漂变

2. 天然免疫

3. 体液免疫

4. CD4+T细胞

5. CD8+T细胞

6．药物

7. HCV的回复突变

8. 结论

参 考 文 献

综 述 二

1. HCV的生物学特征

2. HCV的异质性

3. HCV基因分型的生物学意义

4. 结语

参 考 文 献

致谢