P120及NF-κB在脂多糖致小鼠急性肺损伤气道上皮中的表达变化及相关机制

摘要

一、实验目的
　　本实验使用脂多糖(LPS)气管内注射建立小鼠急性肺损伤模型(ALI),检测在气道损伤修复过程中p120蛋白的表达变化及在细胞内的定位、NF-κB信号通路相关蛋白的表达变化及细胞因子IL-8的表达变化,初步探讨小鼠气道炎症发生过程中的有关机制。
　　二、实验方法
　　C57小鼠随机分为实验组1d、4d、7d、14d组和对照组,每组8只。实验组经气管内注射LPS(5mg/kg),对照组气管内注射等量生理盐水,分别于注射后1d、4d、7d及14d取肺组织。采用HE染色观察各组小鼠的气道上皮形态学变化;免疫组织化学方法检测p120在气道上皮细胞的表达及在细胞内的定位;Westernblot方法分别检测小鼠肺组织内p120、NF-κB亚基p65、p-IκBα及IκBα等表达水平的变化;ELISA(定量酶联免疫吸附实验)检测小鼠肺组织匀浆上清液中NF-κB信号通路下游靶基因之一细胞因子IL-8的表达变化。
　　三、实验结果
　　1、HE染色显示:对照组小鼠支气管黏膜上皮细胞排列整齐,未见明显损伤及修复性变化。实验组小鼠气道上皮呈现了损伤及损伤后增殖、修复的形态学变化。实验1d组小鼠未出现明显的急性炎症变化,气道上皮连续性较好,肺泡也无明显的病理变化。实验4d组小鼠气道黏膜上皮细胞出现明显的坏死、脱落,细支气管腔内及管壁周围见多量炎症细胞浸润,肺泡间隔明显增宽,支气管旁血管扩张、充血,血管周围见多量炎症细胞渗出。实验7d组小鼠支气管壁周围仍见较多炎症细胞浸润,但部分区域肺泡间隔较前有所恢复。实验14d组小鼠细支气管壁炎细胞浸润减少,肺泡间隔基本恢复正常,部分区域细支气管黏膜上皮细胞排列紧密,上皮层次稍增多,呈现增殖变化。
　　2、免疫组化染色显示:p120在对照组小鼠气道上皮呈现围绕气道上皮细胞连续棕黄色线状表达,在实验组小鼠气道上皮的细胞膜表达呈现先减少后逐渐恢复趋势。实验1d组,p120仍表现为沿气道上皮细胞膜呈棕黄色连续线状表达;实验4d组和7d组,p120在小鼠气道上皮细胞膜上表达明显减少,部分区域见细胞质内表达;实验14d组,部分区域恢复p120在小鼠气道上皮细胞膜上棕黄色连续线状表达。各实验组与对照组相比均有明显的差异(p<0.05)。
　　3、Westernblot检测显示:
　　1)与对照组小鼠肺组织内p120表达水平相比较,实验组小鼠肺组织内p120蛋白水平呈现出先降低后逐渐恢复的趋势,实验1d组和4d组p120蛋白水平下降较明显,7d组和14d组p120蛋白水平有所上升,但仍低于对照组。各实验组与对照组之间p120蛋白水平差异具有统计学意义(p<0.05)。
　　2)与对照组小鼠肺组织内NF-κB表达水平比较,实验组小鼠肺组织内NF-κB表达呈现出先增加、后逐渐降低的动态变化,其表达变化的趋势与p120的变化趋势相反,即实验1d组和4d组NF-κB表达增加,7d组和14d组NF-κB表达逐渐降低至接近对照组水平。实验1d组、4d组和7d组与对照组比较NF-κB表达差异明显,具有统计学意义(p<0.05);实验14d组与对照组比较差异无统计学意义。
　　3)与对照组比较,小鼠肺组织内p-IκBα呈现先增加后减少趋势,IκBα则先因磷酸化增加而表达减少,后因磷酸化降低而表达增加。实验1d组、4d组及7d组与对照组之间差异明显,具有统计学意义(p<0.05),实验14d组与对照组之间差异无统计学意义。
　　4、ELSIA结果显示:LPS刺激C57小鼠后,IL-8的表达水平先增加后降低。各实验组与对照组表达水平差异明显,具有统计学意义(p<0.05)。
　　四、实验结论
　　由LPS所致的小鼠ALI,可能通过下调气道上皮细胞内p120表达并致其发生细胞内定位的改变,引起IκBα发生磷酸化并降解,从而活化NF-κB信号途径,促进前炎症因子IL-8等的生成与分泌,参与气道炎症反应和增生修复过程。

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声明

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中文摘要

英文摘要

主要中英文缩略词表

前言

材料和方法

材料

一、实验动物

二、主要试剂

三、主要抗体

四、主要仪器

方法

一、动物模型的建立【23】

二、动物处理

三、免疫组织化学染色（采用Envision二步法）

四、提取组织总蛋白并测定蛋白浓度

五、Western blot（蛋白质免疫印迹）

六、ELISA（定量酶联免疫吸附实验）检测肺组织匀浆上清液中IL-8表达量

七、免疫组织化学结果分析

八、统计学分析

实 验 结 果

一、LPS致小鼠气道上皮损伤的形态学变化

二、LPS刺激抑制小鼠气道上皮细胞p120表达

三、LPS刺激诱导小鼠肺组织内NF-κB的活化

四、LPS刺激促进小鼠肺组织内IL-8表达

五、LPS刺激引起小鼠肺组织内IκBα表达减少，p-IκBα表达增加

讨论

结论

参考文献

综述

致谢