DNA甲基化调控红豆杉细胞中紫杉醇合成机理初探

摘要

红豆杉细胞系在继代培养过程中存在紫杉醇含量不稳定问题,表现为随着继代次数的增加,紫杉醇含量逐渐下降。前期研究发现,这种不稳定现象与红豆杉细胞系在继代过程中甲基化水平升高有密切关系,但作用机制尚不明确。本研究利用蛋白质组技术对去甲基化试剂(5-Aza-CdR)处理前后的红豆杉细胞进行差异蛋白解析,以期揭示DNA甲基化调控紫杉醇合成的机理,获得的主要结果如下:
　　1)建立了HPLC测定红豆杉基因组DNA甲基化水平的方法。最优的方案为:37℃DNAdegradase(ZymoResearchCorp,Cat.E2017)水解3h;流动相采用:溶剂A为50mmol/L磷酸二氢钾水溶液:三乙胺=100:0.2(pH=5.8),溶剂B为甲醇,梯度设置为10％甲醇,检测波长285nm。此种方法采用酶水解方法实现了仅需3ugDNA就能达到HPLC检测的需求,而且防止了5-甲基胞嘧啶的降解破坏,且此方法具有良好的稳定性和重复性。
　　2)建立了适合红豆杉细胞的蛋白质双向电泳体系。研究表明,采用TCA-丙酮法提取蛋白,pH4-7范围胶条以及改进的IEF聚焦程序,所有样品均获得了清晰的2-DE图谱,可读点都在2000个以上。所建立的实验体系重复性好,为红豆杉细胞蛋白质组学的研究打下了良好的基础。
　　3)通过对去甲基化试剂处理前后的红豆杉细胞总蛋白的2-DE差异蛋白质组学研究,共找到表达差异在1.5倍以上的差异蛋白点121个,质谱鉴定出62个点,其中有33个是新蛋白,功能未知;29个已知功能蛋白,可分为:细胞防御蛋白(Defense/Desease)、碳水化合物代谢蛋白(CarbohydrateMetabolism)、能量代谢蛋白(EnergyMetabolism)、脂代谢蛋白(LipidMetabolism)、次生代谢蛋白(SecondaryMetabolites)、细胞生长和凋亡蛋白(CellGrowthandDeath)、转运和分解蛋白(TransportandCatabolism)及其他(Other)未知功能的蛋白。
　　4)克隆了部分差异表达蛋白及紫杉醇合成相关酶,并采用荧光定量RT-PCR技术对表达量进行分析。结果表明:咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶(F14)基因与蛋白的表达趋势完全相同,分析了微管蛋白(A3)、ATP合成酶(C3)、细胞生长相关蛋白(C4)、S-腺苷甲硫氨酸合成酶(D14)、热休克蛋白(E3)、肌动蛋白(M1)6个基因与蛋白的表达量存在差异,推测由于生物体转录后调控,从而导致基因与蛋白水平表达趋势的差异;发现5-Aza-CdR对甲基转移酶基因MET5的影响较大,对MET1、MET4的影响较小,说明5-Aza-CdR对甲基转移酶的影响具有选择性;发现5-Aza-CdR处理后紫杉醇合成过程中的关键酶基因(TS、DBAT、BAPT)的表达量均提高。
　　5)通过对去甲基化试剂处理不同时期红豆杉细胞的蛋白水平及基因水平的综合分析,初步预测了甲基化调控紫杉醇合成的机理。5-Aza-CdR处理红豆杉细胞后能够降低细胞基因组甲基化水平,同时激活了多种途径来参与紫杉醇的合成。①5-Aza-CdR能够激活能量代谢途径、磷酸戊糖途径、脂肪酸代谢途径及其他生物学途径,这些途径能够为紫杉醇的合成提供NADPH、能量、乙酰辅酶A、3-磷酸甘油醛等物质与能量基础。②同时5-Aza-CdR刺激了紫杉醇合成途径中关键酶基因的表达,故紫杉醇含量在甲基化水平降低的同时不断提高。③随着紫杉醇含量的提高及甲基化酶与DNA共价体的进一步合成,对细胞造成伤害,通过信号转导途径,最终引起植物的胁迫反应。随着5-AZa-CdR浓度及活性的降低,其对甲基化的抑制作用降低,故处理后期对甲基化水平的抑制不明显,被激活表达的基因被重新甲基化从而沉默表达,造成紫杉醇含量的降低。

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1. 前言

1.1红豆杉细胞培养生产紫杉醇不稳定性研究进展

1.2 DNA甲基化调控生物学性状及其检测方法研究进展

1.2.1 DNA甲基化调控生物学性状研究进展

1.2.2改变基因组DNA甲基化水平的方法

1.2.3 DNA甲基化检测方法

1.3植物蛋白质组学研究进展

1.3.1总蛋白的提取

1.3.2双向电泳分离

1.3.3植物蛋白组学技术应用

1.4本研究的目的意义和主要内容

2. 材料与方法

2.1实验材料

2.2实验方法

2.2.1细胞鲜重和干重的测定

2.2.2红豆杉细胞及培养液中紫杉醇含量测定

2.2.3高效液相色谱检测甲基化水平方法

2.2.4植物蛋白组学研究方法

2.2.5相关功能蛋白及甲基转移酶cDNA的获得

2.2.6荧光定量PCR方法建立

3. 结果与分析

3.1红豆杉细胞DNA甲基化水平HPLC检测方法的建立

3.1.1 DNA提取

3.1.2 DNA水解

3.1.3流动相的选择

3.1.4 HPLC检测DNA甲基化水平的方法评估

3.2红豆杉细胞蛋白质双向电泳技术优化

3.2.1组织破碎

3.2.2次生代谢物的去除

3.2.3红豆杉细胞总蛋白提取方法的研究

3.2.4红豆杉细胞蛋白双向电泳条件优化

3.3 5-Aza-CdR处理对红豆杉细胞生物学性状的影响

3.3.1 5-Aza-CdR处理对红豆杉细胞生物量的影响

3.3.2 5-Aza-CdR处理对红豆杉细胞甲基化水平的影响

3.3.3 5-Aza-CdR处理对红豆杉细胞紫杉醇含量的影响

3.4红豆杉细胞在5-Aza-CdR处理前后蛋白质组学研究

3.4.1 5-Aza-CdR处理前后样品的双向电泳分析

3.4.2 5-Aza-CdR处理前后过程中表达差异蛋白分析

3.4.3质谱鉴定出的差异蛋白的功能分析

3.5差异功能蛋白及关键酶cDNA的获得

3.5.1序列的获得及引物设计

3.5.2 PCR扩增

3.5.3序列测定

3.6差异功能蛋白及关键酶基因的定量表达分析

3.6.1总RNA纯度和完整性的鉴定

3.6.2蛋白及酚类杂质去除干净

3.6.3 PCR产物检测

3.6.4 Real-time RT-PCR 检测基因的表达量

3.7 DNA甲基化调控紫杉醇合成的代谢通路分析

4. 总结与展望

4.1全文总结

4.2展望

致谢

参考文献

硕士期间已发表或拟发表文章