利用蛋白质组学技术解析化学杀雄剂SX-1致使甘蓝型油菜雄性不育机理研究

摘要

油菜作为重要的油料作物,在中国的种植面积和产量均排世界第一。目前,油菜育种学家主要致力于提高油菜产油量,而杂种优势利用是提高产油量的最为有效的途径之一。化学杂交育种由于克服了传统杂交育种手段的众多缺点,比如育种周期长,核质效应,不育系容易受环境影响等缺点,化学杀雄剂同时兼备使用方便,低毒,育种周期短等众多优点而颇受青睐。目前,对于化学杀雄剂致使雄性不育机理的研究尚少,本文对化学杀雄剂处理的油菜雄蕊进行了形态学和蛋白质组学方面的研究,以期探究化学杀雄剂致使甘蓝型油菜雄性不育的原因。本文得到的主要结果如下:
　　(1)利用石蜡切片、扫描电镜以及透射电镜技术,观察了化学杀雄剂处理后的花药变化。研究表明,在花粉发育到第8个时期时,绒粘层细胞发育出现代谢紊乱,细胞内的绒粘层小体与造油体提前降解,绒粘层细胞程序化死亡(Programmed Cell Death,PCD)过程出现紊乱。对照组绒粘层细胞PCD过程降解较为完全,而处理组绒粘层细胞在降解出现紊乱后堆积于花药内壁。化学杀雄剂处理后花粉外壁填充出现紊乱,从而对柱头识别和粘附作用受到影响,进而造成育性下降。研究发现化学杀雄剂发生关键作用时期在甘蓝型油菜花粉发育第8、9两个时期,这为化学杀雄剂使用关键时期的选择和蛋白质组学技术研究提供了形态学和理论参考。
　　(2)通过建立甘蓝型油菜花药蛋白质组学体系,提取对照组与处理组花药蛋白进行双向电泳分析,分离差异蛋白,并作质谱分析,得到一系列差异蛋白鉴定结果。本实验总共对差异表达的119蛋白进行了质谱鉴定,其中成功鉴定了101个差异蛋白,根据功能分为13大类,主要集中在氨基酸代谢相关蛋白、碳水化合物代谢相关蛋白、油脂合成相关蛋白等。其中在缬氨酸、亮氨酸与异亮氨酸合成与水解途径中,化学杀雄剂的靶点基因乙酸乳酸合成酶基因正好位于该条途径当中,分离的差异蛋白分别位于靶标蛋白的上游和下游,并且均出现2倍以上差异表达,根据以上结果可以推测,化学杀雄剂处理花药后基因差异表达可能与该途径密切相关。而在前人报道中也提到过化学杀雄剂会使不育系中游离氨基酸的含量下降。通过分析这些差异蛋白,发现还有很多差异蛋白与糖类代谢相关,这表明在化学杀雄剂处理后糖类代谢的酶会下降表达,这些酶类的下降表达会对能量物质的积累和脂肪酸积累产生影响,而花粉细胞发育所需要的营养物质与脂肪酸都会受到很大影响,最终可能会造成甘蓝型油菜育性下降。
　　(3)对差异表达的部分蛋白质进行了表达分析,荧光定量PCR分析结果显示化学杀雄剂处理后,ACTIN12,auxin reponsive-like protein,carboxypeptidase,chalcone synthase 3 protein,Cysteine protease,protein disulfide isomerase precursor-like,protein TAPETUM 1,7个已经报道的与雄性育性相关蛋白,在花粉发育第8、9个两个关键时期时有6个蛋白出现下降表达,这些蛋白的下降表达均会在不同程度上造成甘蓝型油菜雄性不育的发生。

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1 前言

1.1 甘蓝型油菜杂种优势利用研究进展

1.2 植物雄性不育的研究现状

1.2.1 植物自然败育雄性不育研究现状

1.2.2 化杀剂引起植物雄性不育研究现状

1.3 植物蛋白质组学研究进展

1.4 课题意义

2 化学杀雄剂SX-1处理甘蓝型油菜花药的形态学变化分析

2.1 材料与方法

2.1.1 材料

2.1.2 实验方法

2.2 实验结果

2.2.1甘蓝型油菜花药解剖结构观察

2.2.2甘蓝型油菜花粉粒卡宝染色观察

2.2.3甘蓝型油菜花粉细胞透射电镜观察

2.2.4甘蓝型油菜花粉细胞外壁透射电镜观察

2.2.5甘蓝型油菜花药绒粘层透射电镜观察

2.2.6甘蓝型油菜花粉细胞扫描电镜观察

2.3 讨论

3 化学杀雄剂SX-1处理甘蓝型油菜诱导雄性不育的蛋白质组学分析

3.1 材料与方法

3.1.1 材料

3.1.2 实验方法

3.1.3 SDS-PAGE

3.1.5 差异蛋白点质谱分析

3.1.6 荧光定量PCR分析差异表达基因

3.2 实验结果

3.2.1甘蓝型油菜花药蛋白SDS-PAGE结果

3.2.2 甘蓝型油菜花药总蛋白双向电泳

3.2.3 甘蓝型油菜总蛋白差异表达蛋白质点的质谱鉴定

3.3 讨论

4 总结与展望

4.1 全文总结

4.2 展望

致谢

参考文献