应激性心肌病大鼠体内NPY与PGC-1α表达含量以及死后心肌组织内NPY检测

摘要

研究背景:
　　人类一直对情绪与心脏功能之间的密切联系有着直觉认识。目前，流行病学资料表明，强烈的情绪刺激与心血管疾病发病率及死亡率之间存在联系。应激是机体对诸如周围环境改变以及刺激等作出的一种反应。在过去的几年间，一种新的由强烈情绪刺激引起的一过性左心室收缩功能障碍被报道，称为应激性心肌病（stress cardiomyopathy，SC）。应激性心肌病的一个主要特点是情绪刺激后左室心尖部呈一过性畸形（运动障碍），形状类似于日本渔民捕章鱼的所用的篓（takotsubo），故也被称为takotsubo心肌病。截止到目前，针对这种心肌疾病的病理机制提出了很多假说，并仍在研究中。另外，国内外的研究也发现除一过性心室畸形，应激性心肌病患者还可以见到其他如心电图ST段抬高、轻度心肌酶谱升高等临床指标。此外，在应激性心肌病中并未发现心肌梗死等病理改变及冠状动脉狭窄或供血不足。许多研究者认为是脑-心脏或心脏-脑联系在此类心肌病中扮演重要角色，而另外的学者将研究重点集中在细胞分子学方面。
　　由于缺乏足够有意义的充分证据（如病理改变等），在法医学领域中诊断应激性心肌病引起的死亡也面临困境。此外，在许多案例报道了强烈的情绪刺激后发生死亡，这些案例通常表现为“阴性”的解剖结果。
　　NPY是一种氨基酸肽类神经递质，可在交感神经兴奋时释放至各器官，包括心脏及脑。在国内外的相关研究中表明NPY在调节心血管活动中发挥着重要作用。PGC-1α是一种转录辅助活化因子，可辅助激活、增加相关基因的转录，在哺乳类动物的能量代谢方面具有重要作用，并在多种心肌病变中扮演重要角色。但NPY及PGC-1α二者在应激性心肌病中的表达及作用尚无研究报道。
　　在本课题中，研究了应激性心肌病动物模型体内NPY和PGC-1α的表达和检测，并且还对大鼠心肌中NPY含量随时间改变的死后检测进行了评价。
　　目的:
　　建立应激性心肌病大鼠模型，在此基础上，检测NPY以及PGC-1α的表达含量。另外，研究应激性心肌病大鼠死后心脏组织中NPY含量检测的可能性。因此，涉及步骤如下：
　　1.建立大鼠应激性心肌病模型（体位限制法）
　　2.对已知的与应激性心肌病有关临床检查指标进行检测
　　3.检测应激性心肌病动物模型体内NPY及PGC-1α的表达水平
　　4.在现实保存尸体的条件下，设计可行的分析方法来检测组织中NPY表达水平并研究在大鼠死后心肌组织中NPY的检测时限
　　方法:
　　1、健康雄性SD大鼠25只，体重250~300g，购自华中科技大学同济医学院实验动物中心。大鼠随机分为5组，每组5只大鼠，依次编号ABCDE。A组给予持续1h的应激刺激，B组持续2h，C组持续3h，D组持续4h，E组为对照组。对照组大鼠分别置于5个笼中，饲养在单独的“隔离室”中，以避免任何应激刺激可能造成的影响。大鼠腹腔注射戊巴比妥钠（30mg/kg）麻醉成功后用胶带将大鼠呈仰卧位固定于木板上，以造成对其应激刺激。大鼠自胸骨至左前肢的胸前区去毛，在大鼠麻醉状态及清醒状态分别行心电图和超声心动图检查。各实验组大鼠在相应应激刺激时间结束后处死，剪开胸腔，抽取心血，剪取心脏。对收集的血液样本进行肌酸激酶（creatine kinase，CK）和肌钙蛋白T（cTnT）的免疫检测，心脏组织行常规H&E染色及Masson染色。对照组给予麻醉，相应时间处死后，检测方法及指标同实验组。
　　2、实验第二部分应激性心肌病大鼠模型建立与第一部分相同。在该部分实验中，采用免疫荧光法对大鼠左心室组织进行NPY的分布以及定量分析；应用半定量RT-PCR方法评估大鼠心肌组织PCG-1α的表达情况。选择NPY表达含量最高的刺激时间点NPY含量作为标准样品值。
　　3、在实验第三部分，取27只SD大鼠（平均体重250g/只）随机分为实验组A（n=22）和对照组B（n=5），应激刺激方法同前述，采用体位限制法。实验组大鼠在特定刺激时间点后处死（时间点选择根据第2部分实验所获得的NPY标准样品值）处死后，所有大鼠用细纱布包裹后4℃冷藏。该温度与现实中大多数停尸间短期保留尸体时所用的温度相同。并于死后当日、死后第1d、第2d、第3d，直至第10d分别行解剖并取心脏。每个时间点选用2只实验组大鼠及1只对照组大鼠。剪取大鼠左心室组织，并制作5张连续切片。对大鼠左心室组织行NPY定性定量免疫荧光检测，并用计算机图像分析系统对NPY的表达进行分析。最终结果表示为在特定时间点的刺激后NPY含量的百分比值，并在各组间进行统计学分析。
　　结果:
　　1、SC建模成功。心电图率先观察到典型的ST段抬高，并在应激刺激3h后更为显著。超声心动图观察到实验组大鼠左心室功能障碍。应激刺激3h和4h后H&E染色切片观察到心肌组织心肌变性、坏死、轻度炎细胞浸润。实验组血液CK表达水平增高，Masson染色显示无心肌纤维化或偶见散在纤维化。实验组大鼠血中cTnT水平与对照组相比显著提高，而CK含量轻度增加，与对照组相比无显著性差异。
　　2、应激刺激1h至4h的实验组大鼠均可观察到NPY免疫荧光阳性表达。图像分析结果示1h至3h组荧光密度和强度呈显著性增高，且在3h组达到峰值。对照组可见点极少量的、灶性分布、颜色浅淡的NPY阳性表达。半定量RT-PCR结果显示，与对照组相比，应激刺激3h和4h的实验组大鼠可检见PCG-1αmRNA含量显著增加。而应激刺激1h和2h的实验组中则没有明显表达。因此，NPY含量的标准值出现在体外限制法刺激3h后。
　　3、死后1d，NPY主要分布在死后组织心肌细胞间的细纤维中。免疫反应阳性表达范围随死后时间延长而逐渐减少。也就是说，与死后0d样本结果（初始值）相比，荧光密度和强度以非线性模式减少。死后第4d和第5d，NPY荧光值降至初始值的一半。死后第8天，组织内NPY无法检测。
　　总结：
　　1、制动技术能够诱导大鼠发生应激性心肌病。
　　2、NPY和PGC-1α在应激性心肌病大鼠心肌组织呈阳性表达，NPY在应激刺激3h后表达水平达到峰值，PGC-1α在应激刺激4h后表达水平达到峰值。
　　3、应激性心肌病大鼠死后4℃冷藏，7d内仍可检出NPY表达，冷藏8d之后，NPY表达阴性。
　　不足之处：
　　1、本课题以大鼠作为实验对象，若扩展至人体实验需做更为深入的研究。本实验大鼠均为雄性，雌激素是否影响实验结果，论文并未对此进行讨论。
　　2、本课题实验样本数量较少，认为大规模样本量更为有益。

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中文摘要

英文摘要

Foreword (前言)

参考文献

Main Text (正文)

[Part 1] Establishing the rat model of stress cardiomyopathy and assessing the respective parameters.

参考文献

[Part 2] Expression of Neuropeptide Y and PGC-1α in the model of stress cardiomyopathy

参考文献

[Part 3] Postmortem detection of NPY in heart tissue of rats following stress cardiomyopathy.

参考文献

Review (综述1)

参考文献

REVIEW 2 (综述2)

参考文献

Publications (攻读博士学位期间发表的论文)

致谢