核因子E2相关因子2基因多态性与氧化应激及2型糖尿病易感性的关联研究

摘要

2型糖尿病(type2 diabetes mellitus,T2DM)正成为21世纪威胁人类健康的慢性重大性疾病之一,被世界卫生组织称作为21世纪的灾难。国际上糖尿病的患病率一直在增长,据估计,成人患糖尿病的人数从1980年的1.53亿增加到2008年的3.47亿。并且据世界卫生组织估计,到2030年全球将有3.66亿人患有糖尿病。
　　氧化应激在T2DM的发生、发展过程中起关键性的作用。糖尿病是由于胰岛素分泌和/或作用异常,所导致的碳水化合物、脂肪以及蛋白质代谢异常,从而引起以高血糖为主要特征的一组代谢性疾病。许多研究结果表明,慢性高血糖引起活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平上升,超出了机体抗氧化系统的清除能力,从而使机体处于氧化应激状态。氧化应激和糖尿病的发生以及发展密切相关,氧化应激影响胰岛素合成和分泌,促进了糖尿病的发生。能够导致肌肉、脂肪及肝脏等组织细胞损伤影响胰岛素敏感性,使血糖持续升高,糖尿病又进一步加强了氧化应激。
　　近年来的大量研究表明,核因子E2相关因子2(NF-E2 related factor 2,Nrf2),在氧化应激相关疾病的发生发展中起着重要作用。在各种氧化应激的刺激下,Nrf2转入胞核内,识别并结合抗氧化反应元件(antioxidant response element,ARE),Nrf2通过ARE的转录激活能够对抗氧化损伤和炎症,通过与ARE结合,Nrf2蛋白能够诱导抗氧化基因的表达。Nrf2/ARE通路的激活,可减少高糖因素所产生的活性氧,发挥其抗氧化应激损伤以及抗慢性炎症反应的作用,改善氧化应激所诱导的胰岛素抵抗。研究表明Nrf2基因的单核苷酸多态性与氧化应激相关疾病如创伤后急性肺水肿等的易感性有明显关联。但是,Nrf2基因的单核苷酸多态性与糖尿病易感性的关系未见相关报道。
　　自由基主要氧化损伤DNA、蛋白以及脂质等生物分子,所以检测组织或生物体液中的氧化应激的代谢产物对于评价机体的氧化应激状态起重要作用。在抗氧化防御体系中,主要包括的抗氧化酶为谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-PX)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和过氧化氢酶(catalase,CAT),能协助清除自由基,减轻以及消除氧化损伤。在生物膜脂质的磷脂中饱含多不饱和脂肪酸(poly-unsaturated fatty acid,PUFA),在O2存在的条件下,这些多不饱和脂肪酸极易受到自由基和其活性衍生物的攻击,引起脂质过氧化的链式反应,同时在脂质过氧化过程中所生成的LO、LOO等也能产生链引发以及链扩增反应。LOO还能通过分子内的双键加成,生成环过氧化物以及环内过氧化物自由基,最后可断裂成各种的代谢产物。过氧化脂质通过脂氧基的β断裂能产生许多醛类,如丙二醛。因此测定生物样品中的丙二醛可反映脂质过氧化程度,从而能反映糖尿病患者的氧化应激状态。
　　因此本研究的目的是拟采用TaqMan方法对Nrf2的基因的单核苷酸多态性位点的进行基因分型;同时检测氧化应激和抗氧化状态的相关标志物,以探讨Nrf2基因多态性与氧化应激及2型糖尿病发病风险的关联;揭示Nrf2基因多态性与2型糖尿病发病易感性的关系,为预防和治疗T2DM提供科学依据和理论指导。
　　第一部分：氧化应激和抗氧化状态与2型糖尿病的相关性研究
　　目的:评价糖尿病患者、糖调节受损患者、以及正常对照组被试者的氧化应激状态和抗氧化能力。
　　方法:用GOD-POD法测定血浆FPG,ECLIA法测定FPI,利用稳态模式评估法进行评估HOMA-IR和HOMA-βcell。采用高铁还原法检测血浆中的TAOC水平,TBA比色法检测血浆MDA浓度,钼酸铵比色法检测血浆中的CAT活性,黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶-亚硝酸盐方法检测红细胞SOD的活性,Beutler改良法测定红细胞的GSH含量,DNTB比色法来检测红细胞GSH-Px的活性。使用ANOVA分析和SNK进行检验,并比较氧化应激和抗氧化状态与糖调节受损和糖尿病风险之间的可能联系。
　　结果:本次研究总共检测2517名被试者,包括IGR306例、T2DM患者884例和NGT1327例。与正常糖耐量的对照组相比,T2DM患者血浆TAC水平(T2DM8.86±0.13U/mlvs.NGT9.57±0.17U/ml;P=0.001),CAT活性(CAT:T2DM32.04±1.04KU/Lvs.NGT41.71±1.65KU/L,P<0.001),红细胞SOD活性(T2DM9997.75±164.01U/gHbvs.NGT11024.28±299.13U/gHb,P=0.002)GSH-Px的活性(T2DM129.97±2.83AUvs.NGT145.63±4.32AU,P=0.002)和GSH含量(T2DM18.94±0.29mg/gHbvs.NGT20.87±0.48mg/gHb,P=0.003)是明显降低地,而其血浆MDA浓度明显地增高(T2DM6.52±0.18nmol/Lvs.NGT5.79±0.12nmol/L;P=0.001)。T2DM患者具有明显高地HOMA-IR值(T2DM4.26±0.13vs.NGT2.17±0.11;P<0.001),而HOMA-β值则显著下降(T2DM44.40±1.78vs.NGT103.37±5.01;P<0.001)。
　　结论:T2DM患者具有明显增加地血浆MDA浓度,然而血浆TAC和CAT活性、红细胞SOD活性、GSH-Px活性以及GSH含量出现明显地降低。这些结果表明,抗氧化能力下降和自由基产生明显增加与2型糖尿病有很强的关联性。
　　第二部分：核因子E2相关因子2基因多态性与氧化应激的相关性研究
　　目的:探讨Nrf2rs6721961基因多态性与氧化应激之间的关系,检测该基因多态性与机体的抗氧化能力强度有无关联。
　　方法:使用TaqMan探针对Nrf2rs6721961位点进行基因分型。采用高铁还原法检测血浆中的TAOC水平,TBA比色法检测血浆MDA浓度,钼酸铵比色法检测血浆中的CAT活性,黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶-亚硝酸盐方法检测红细胞SOD的活性,Beutler改良法测定红细胞的GSH含量,DNTB比色法来检测红细胞GSH-Px的活性。
　　结果:本部分病例对照研究共纳入被试者2477例,其中包括879例2型糖尿患者和1295例NGT正常对照人群。与CC基因型携带者相比,AA基因型携带者的血浆TAC水平(AA8.73±0.22vs.CC9.23±0.08U/ml,P=0.025),CAT活性(AA34.41±0.58vs.CC38.14±0.41KU/L,P=0.001),红细胞SOD活性(AA10446.01±118.61vs.CC10809.65±64.64U/gHb,P=0.042),GSH-Px活性(AA133.57±3.61vs.CC140.57±1.06AU,P=0.020),和GSH含量(AA19.49±0.31vs.CC20.10±0.10mg/gHb,P=0.042)也是明显降低的,而血浆中的丙二醛(MDA)的浓度(AA6.42±0.26vs.CC5.84±0.11nmol/ml,P=0.005)明显地增加。基因型AA携带者与基因型CC携带者相比较具有明显高的HOMA-IR值(AA2.90±0.19vs.CC2.36±0.06,P=0.003)和明显低地β细胞功能水平(AA71.37±4.05vs.CC84.37±1.59,P=0.005)。
　　结论:Nrf2rs6721961单核苷酸多态性的与氧化应激以及抗氧化状态密切相关。与基因型CC及基因型CA携带者相比,基因型AA携带者在血浆TAC和CAT活性,红细胞的SOD和GSH-Px活性以及红细胞GSH含量明显降低,而血浆丙二醛水平明显增高。
　　第三部分：核因子E2相关因子2基因多态性与2型糖尿病和糖调节受损的风险关联研究
　　目的:探讨Nrf2rs6721961基因多态性与2型糖尿病和糖调节受损发病风险之间的关联关系。
　　方法:用GOD-POD法测定血浆FPG,ECLIA法测定FPI,利用稳态模式评估法进行评估HOMA-IR和HOMA-βcell。使用TaqMan探针对Nrf2rs6721961位点进行基因分型。
　　结果:本部分病例对照研究共纳入被试者2477例,其中包括879例2型糖尿患者,303例IGR和1295例NGT正常对照人群。Nrf2rs6721961基因多态性的等位基因的频率在2型糖尿病的病例和对照之间有显著性差异。与NGT组受试者(26.1％)相比较,A等位基因的频率(29.4%)在2型糖尿病的被试者明显地较高(P=0.019)。Nrf2rs6721961是与增加地患糖尿病的风险密切相关联。与CC基因型携带者相比较,携带AA基因型的个体有显着增加的发展2型糖尿病的风险(OR=1.77,95%CI1.26,2.49,P=0.011)。经校正年龄,性别,身体质量指数等混杂因素后,该关联仍具有统计学意义(OR=1.56,95%CI1.11,2.20,P=0.014)。与CC基因型携带者相比较,AA基因型携带者HOMA-β值显著降低(AA71.37±4.05vs.CC84.37±1.59,P=0.005),而HOMA-IR值显著增加(AA2.90±0.19vs.CC2.36±0.06,P=0.003)。
　　结论:Nrf2基因rs6721961多态性与T2DM易感性存在明显关联。与CC基因型携带者相比较,AA基因型携带者患T2DM以及糖调节受损的风险明显增加。

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中英文缩略词表

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英文摘要

前言

第一部分 氧化应激和抗氧化状态与2型糖尿病的相关性研究

前言

材料和方法

结果

讨论

第二部分 核因子E2相关因子2基因多态性与氧化应激的相关性研究

前言

材料与方法

结果

讨论

第三部分 核因子E2相关因子2基因多态性与2型糖尿病的风险关联研究

前言

材料和方法

结果

讨论

小结

参考文献

综述

博士研究生期间工作小结

致谢