慢病毒载体介导Blimp1-shRNA反义基因治疗调控髓源性DC前体细胞分化的研究

摘要

目的:慢病毒(lenti-virus)为载体介导Blimpl-shRNA转染向树突状细胞(dendritic cells,DCs)分化的骨髓原代细胞,观察转染效率、细胞生长及分化成熟情况。
　　方法:构建Blimpl-shRNA,用慢病毒载体将此序列转染于小鼠骨髓原代细胞中并诱导向DC分化;根据转染条件将实验分为空白对照(empty-control)组、空载病毒对照(lenti-control)组和慢病毒-BlimplshRNA(Ienti-Blimpl)组;于I周内观察荧光水平以评估转染效率,观察细胞的形态变化,记录细胞的生长情况;分别于转染后72h、96h收集细胞比较各组Blimpl mRNA、蛋白的表达情况;收集转染后第7天细胞,检测CDllc+、CD86+、MHCII+细胞百分比。
　　结果:病毒侵染后第3天细胞出现焚光,lenti-control组和Ienti-Blimpl组焚光表达率为30.8±4.4％、30.4±4.8%,而后灰光持续并稳定;生长曲线显不,Empty-control组细胞在培养的前3天内呈对数增长,第4天细胞数目达到峰值(2.45±0.26><106/孔),培养第6天后细胞数目略有下降(2.35±0.20xl06/孔),至第8天为2.27±0.19xl06/孔;lenti-control组和Ienti-Blimpl组细胞在病毒侵染后,细胞增殖停滞,随后细胞数目稳定在1.69±0.39><106/孔;Ienti-Blimpl组BlimplmRNA和蛋白的水平为lenti-control组的1.3%和70.4%,为empty-control组的1.0%和74.0%;empty-control组、lenti-control组和Ienti-Blimpl组中CDllc+细胞百分比为69.24±4.98%、68.56±5.86%和72.76±5.52%,而empty-control组、lenti-control组和Ienti-Blimpl组中CD86+和MHCII+细胞百分比分别为51.08±4.93%、49.52±4.28%、50.20±6.01%和56.28±7.30%、69.38±4.52%、46.48±5.70%。
　　结论:Blimpl基因的下调能够抑制DC成熟,慢病毒介导的ShRNA基因治疗是调控髓源性DC前体细胞Blimpl基因的有效手段。

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缩略语表

中文摘要

英文摘要

刖目

材料和方法

一、材料

二、分组

三、小鼠DCs培养

四、ShRNA的设计与合成

五、慢病毒载体的构建及筛选

六、慢病毒载体感染骨髓原代细胞

七、Real time PCR检测 mRNA 水平

八、Western b lo t检测蛋白表达

九、流式细胞术检测

十、统计学分析

结果

I 转染效率

2 细胞生长情况

3 反义基因治疗对B lim p l的表达影响

4 流式细胞术检测结果

讨论

参考文献

综述

参考文献

致谢