靶向下调RVM区TPH2表达抑制小鼠瘙痒及其机制研究

摘要

研究背景：
　　瘙痒被定义为一种能引发搔抓欲望的特异性皮肤不适感觉,通过搔抓来消除皮肤表面潜在的有害因素如寄生虫等。同时,瘙痒也是一些慢性疾病的表现,如慢性胆汁郁积症。由于对不同原因引起的瘙痒在感觉神经回路中传导机制的认识不足或有限,导致目前缺乏对慢性瘙痒的有效治疗手段。
　　瘙痒和慢性疼痛同属于伤害性感觉,多数C-纤维可对诱导疼痛和诱导瘙痒的化合物作出反应,在二者传导通路中起重要作用。脑干延髓头端腹内侧区(rostralventromedialmedulla,RVM)是对脊髓水平伤害性刺激下行调节系统中的一个重要组成部分。并且RVM区内的神经元在脊髓伤害性信号传导的抑制和易化作用中扮演着重要角色。最近的研究证实,RVM区对脊髓水平的伤害性信号传递的易化作用促成了神经病理性疼痛的产生与发展。据此可推测,RVM区对脊髓水平的伤害性信号传导的易化作用同样可以促成慢性病理性瘙痒的形成。
　　最近的研究支持RVM区的5-HT系统参与组织和神经损伤后脊髓水平伤害性信号的下行易化作用。而且,脊髓的5-HT3受体活化被证实参与了脊髓损伤(spinalcordinjury,SCI)模型大鼠痛觉过敏的产生。抑制脊髓5-HT3受体可减少L5-L6脊神经结扎模型(spinalnerveligation,SNL)的痛觉过敏。据此推测RVM区的5-HT能系统可能通过参与交感神经的活化调节慢性瘙痒信号的传递。
　　目的：
　　1、为提供RVM区5-HT能神经元参与慢性瘙痒的直接证据,我们通过RVM区注射神经毒素5,7-双羟色胺(5,7-DHT)选择性化学破坏5-HT能神经元后,观察慢性瘙痒模型(经颈背区皮内注射组胺、氯喹、内皮素-1诱导)小鼠搔抓行为的变化。
　　2、基于色氨酸羟化酶-2(tryptophanhydroxylase-2,TPH2)是脑神经元中5-HT的生物合成限速酶,同时也是中枢5-HT能神经元的标志物,本研究通过RNA干扰(RNAinterference,RNAi)技术抑制TPH2的合成,观察慢性瘙痒模型(经颈背区皮内注射组胺、氯喹、内皮素-1诱导)小鼠搔抓行为的变化,以确定下行5-HT在小鼠慢性瘙痒中的作用。
　　研究方法与结果：
　　1、构建小鼠瘙痒模型
　　方法:雄性C57BL/6J小鼠(8-10周龄)随机分为:正常对照组(N组,n=6);生理盐水组(S组,n=6);组胺组(His组,n=6);氯喹组(CQ组,n=6)和内皮素-1组(ET-1组,n=6)。正常对照组不接受任何处理,其余组分别在小鼠接受颈背部皮内注射生理盐水(100μl)、组胺(500μg/100μl)、氯喹(200μg/100μl)、内皮素(25ng/100μl)后,立刻以5min为一个周期记录搔抓次数,记录30min。
　　结果:N组5.83±1.67次、S组5.67±1.11次、His组91.83±24.17次、CQ组117.67±24.00次、ET-1组187.83±38.50次。与N组、S组比较,His组、ET-1组、CQ组给予致痒剂后30min内搔抓次数增多有统计学差异(P<0.05);N组和S组之间比较给予致痒剂后30min内搔抓次数无统计学变化(P>0.05)这些结果表明,皮内注射组胺、氯喹和内皮素-1可引起明显的瘙痒行为学改变。
　　2、5,7-DHT选择性破坏小鼠RVM区5-HT能神经元对瘙痒的影响
　　方法:在RVM区注射生理盐水(0.5μl)或神经毒素5,7-DHT(2μg/0.5μl)选择性消融5-HT能神经元4d后,将雄性C57BL/6J小鼠随机分为:组胺组(DHT-His组,n=6)、氯喹组(DHT-CQ组,n=6)和内皮素-1组(DHT-ET-1组,n=6)及相应的对照组胺组(saline-His组,6只)、对照氯喹组(saline-CQ组,6只)和对照内皮素-1组(saline-ET-1组,6只)。分别在小鼠接受颈背部皮内注射组胺(500μg/100μl);氯喹(200μg/100μl);内皮素(25ng/100μl)后,立刻以5min为一个周期记录搔抓次数,记录30min。免疫组化检测RVM区5-HT能神经元的破坏情况,和脊髓背角5-HT表达情况。
　　结果:各组30min内搔抓次数分别为:saline-His组93.67±23.33次、saline-CQ组123.67±18.56次、saline-ET-1组184.33±35.00次、DHT-His组12.83±4.89次、DHT-CQ组18.33±5.33次、DHT-ET-1组60.33±10.33次。与RVM区给予生理盐水的小鼠相比,RVM区给予5,7-DHT组小鼠在给予致痒剂后与正常对照组相比搔抓次数显著减少(P<0.05),RVM区给予生理盐水不影响小鼠在给予致痒剂后的搔抓情况(P>0.05)。免疫组化检测RVM区5-HT能神经元标记物TPH和脊髓背角5-HT,与正常组比较经5,7-DHT处理过的小鼠其RVM内5-HT能神经元及脊髓背角5-HT阳性物明显减少,经生理盐水处理组无明显变化。这些结果表明,RVM区注射神经毒素5,7-DHT选择性破坏5-HT能神经元后,可明显减少由组胺、氯喹和内皮素-1诱发的搔抓次数。
　　3、小鼠TPH2shRNA慢病毒载体的构建及干扰效率鉴定
　　方法:拟通过设计针对小鼠TPH2基因shRNA的寡核苷酸序列,克隆入质粒GV118中。与pHelper1.0和pHelper2.0一起经人胚肾293T细胞包装产生病毒颗粒。经浓缩、滴度测定后感染褐家鼠肾上腺嗜铬细胞瘤PC12细胞。通过荧光显微镜观察病毒细胞形态及病毒表达情况、确定PC12细胞感染慢病毒合适的条件及MOI。Real-timePCR和Westernblot检测我们构建的病毒载体在PC12细胞中抑制TPH2的表达情况。
　　结果:测序结果显示本研究所构建的LV-TPH2与LV-Con质粒与设计合成的干扰序列一致。经293T细胞包装后所得到的病毒LV-TPH2-RNAi和LV-Con-RNAi滴度分别为:1×109TU/ml和2×109TU/ml。感染PC12细胞确定其MOI值为100。Real-timePCR和Westernblot检测与正常对照组相比其mRNA降低约50％,蛋白降低约60%,对照病毒组与正常组无明显变化。这些结果表明,本研究成功构建了小鼠TPH2shRNA慢病毒载体,并能有效的抑制PC12细胞中TPH2的表达。
　　4、运用RNA干扰技术靶向抑制小鼠RVM区5-HT能神经元TPH2的表达对瘙痒的影响
　　方法:在RVM区注射对照病毒和TPH2小干扰RNA病毒特异性减少5-HT能神经元中功能型5-HT含量7d后,将雄性C57BL/6J小鼠随机分为:组胺组(TPH2-His组,6只);氯喹组(TPH2-CQ组,6只),内皮素-1组(TPH2-ET-1组,6只),组胺组(Con-His组,6只);氯喹组(Con-CQ组,6只)和内皮素-1组(Con-ET-1组,6只)。分别在小鼠接受颈背部皮内注射生理盐水(100μl);组胺(500μg/100μl);氯喹(200μg/100μl);内皮素(25ng/100μl)后,立刻以5min为一个周期记录搔抓次数,记录30min。免疫组化检测RVM区5-HT能神经元的破坏情况,和脊髓背角5-HT表达情况。
　　结果:各组30min内搔抓次数分别为:Con-His组104.17±11.56次、Con-CQ组119.50±20.50次、Con-ET-1组169.22±334.83次、TPH2-His组31.00±11.33次、TPH2-CQ组55.17±10.22次、TPH2-ET-1组48.00±5.33次。与正常对照组相比经LV-TPH2-RNAi处理过的小鼠搔抓次数显著减少(P<0.05),经LV-Con-RNAi处理的小鼠与正常对照组小鼠在搔抓次数上无明显变化(P>0.05)。免疫组化检测RVM区5-HT能神经元标记物TPH和脊髓背角5-HT,与正常组比较经LV-TPH2-RNAi处理过的小鼠其RVM内5-HT能神经元及脊髓背角5-HT阳性物明显减少,经LV-Con-RNAi处理组无明显变化。这些结果表明,RVM区注射TPH2的siRNA抑制TPH2表达,,可明显减少由组胺、氯喹和内皮素-1诱发的搔抓次数,同时可检测到脊髓背角5-HT阳性表达产物减少。
　　5、统计学处理
　　采用SPSS17.0统计软件进行处理。计量资料以均数±标准差(x±s)表示,两组数据之间比较采用t检验,多组数据之间比较采用方差分析(ANOVA),P<0.05有统计学差异。
　　研究总结：
　　一、主要研究结果
　　1.RVM区注射5,7-DHT选择性破坏5-羟色胺能神经元后,可明显抑制由组胺、氯喹和内皮素-1诱导的搔抓行为;
　　2.RVM区注射重组siRNA慢病毒抑制TPH2表达后,可抑制由组胺、氯喹和内皮素-1诱导的搔抓行为。
　　二、研究结论
　　1.RVM区5-HT能神经元是瘙痒信号由脊髓传递至大脑过程中的重要环节;
　　2.RVM区5-HT能信号通路在瘙痒信号传递过程中具有重要作用,可能不同程度参与调节不同类型瘙痒信号。
　　三、创新之处
　　1.本研究首次证实了RVM区5-HT能神经元参与了瘙痒信号的传递;
　　2.本研究首次证实了RVM区5-HT能信号通路在调控脊髓瘙痒信号传递过程中具有重要作用。
　　四、展望
　　1.本研究提示5-HT能信号通路是瘙痒信号传递过程中的重要环节,其下游作用受体尚不清楚,深入研究5-HT受体的功能可为临床治疗慢性瘙痒提供新的靶点;
　　2.研究RVM区不同神经元表型和瘙痒的关系,将进一步为我们了解瘙痒机制及其治疗提供新的启示。

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声明

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主要缩略词表

中文摘要

英文摘要

正文

第一部分毁损RVM区5-羟色胺能神经元对小鼠瘙痒行为的影响及其机制

前言

材料与方法

1．实验动物分组与处理

2．主要仪器与设备

3．主要试剂与配方

4．方法与步骤

5、统计学分析

结果

1、小鼠瘙痒行为学检测

2、RVM区给予5,7-DHT对于小鼠瘙痒行为的影响

3、RVM区给予5,7-DHT对小鼠RVM区5-羟色胺能神经元及脊髓5-HT的影响

讨论

参考文献

第二部分靶向下调RVM区TPH2表达对小鼠瘙痒行为的影响及其机制研究

前言

材料与方法

1．实验动物分组与处理

2．主要仪器与设备

3．主要试剂与配方

3．方法与步骤

5．统计学分析

结果

1、阳性克隆测序结果

2、慢病毒滴度测定

3、慢病毒感染PC12细胞

4、Western blot检测慢病毒在PC12细胞中抑制TPH2表达的干扰效率

5、Real-time PCR检测慢病毒在PC12细胞中抑制TPH2表达的干扰效率

6、RVM区给予病毒后对小鼠RVM区5-羟色胺能神经元及脊髓5-HT的影响

7、Western blot检测慢病毒在小鼠体内抑制TPH2表达的干扰效率

8、Real-time PCR检测慢病毒在小鼠体内抑制TPH2表达的干扰效率

9、RVM区注射慢病毒对于小鼠瘙痒行为的影响

讨论

参考文献

综述

致谢

附录