内皮型一氧化氮合成酶的表观遗传学改变在高血糖“代谢记忆”中的作用及机制研究

摘要

目的:高血糖“代谢记忆”效应同糖尿病心血管并发症的发生与发展密切相关,然而其具体机制目前仍尚未明确。血管内皮细胞型一氧化氮合酶(eNOS)功能紊乱在糖尿病血管并发症的发展中发挥了关键总用。因此,本研究拟建立高血糖代谢记忆细胞模型及动物模型,观察eNOS功能紊乱在糖尿病高血糖“代谢记忆”效应中是否发挥了重要作用,并对其具体机制进行探讨。
　　方法:高血糖代谢记忆人主动脉细胞分为4组:1)正常对照组,5.5mM葡萄糖浓度的M200培养基培养4天;2)持续高糖组,30mM葡萄糖浓度的M200培养基培养4天;3)代谢记忆组:30mM葡萄糖浓度的M200培养基培养24h后,转为5.5mM葡萄糖浓度的M200培养基持续培养3天;4)渗透压对照组:24.5mM甘露醇+5.5mM葡萄糖浓度的M200培养基作为渗透压对照组持续培养4天。Wistar大鼠分为3组:1)正常对照组,饲养24周;2)糖尿病组,STZ诱导成模后饲养24周;3)代谢记忆组,STZ诱导成模后高糖状态维持12周,随后使用胰岛素控制血糖至正常范围。检测内皮细胞及大鼠主动脉组织相关指标:内皮细胞一氧化氮(NO)活性水平,前炎症因子MCP-1、ICAM-1及IL-6mRNA的表达水平,细胞及组织内活性氧水平,eNOSmRNA及蛋白的表达水平,以及eNOS(Ser-1177)的磷酸化水平。
　　结果:在人主动脉内皮细胞及大鼠主动脉组织中,高糖导致NO水平持续下降,而前炎症因子MCP-1、ICAM-1、IL-6mRNA的表达水平以及活性氧水平持续升高,同时NOX活性也持续升高,即使血糖降至正常后仍然未恢复。抑制细胞内eNOS活性则可降低细胞及组织中活性氧水平及前炎症因子的表达,而且抑制细胞内NOX活性可恢复细胞内NO生物活性水平。我们进一步发现:高糖导致eNOS持续高表达,而eNOS(Ser-1177)的磷酸化水平则持续下降,即使血糖降至正常后仍然未恢复。
　　结论:早期高血糖诱发了细胞内氧化应激,持续损伤血管内皮舒张功能,诱导前炎症因子的持久高表达,导致持续的血管内皮细胞功能紊乱;而恢复正常血糖后,以上效应仍然持续。功能紊乱的eNOS持久高表达,成为活性氧的持续供体,在高血糖代谢记忆中发挥了重要作用;而NOX在诱发eNOS功能紊乱中发挥了重要作用。
　　目的:有研究表明高血糖导致血管损伤的关键靶基因发生了表观遗传学修饰,参与了高血糖“代谢记忆”效应的形成及发展。我们前期的研究也显示早期高血糖导致内皮型一氧化氮合成酶(eNOS)基因表达活性的持续改变。因此,我们推测高血糖导致了eNOS基因的表观遗传学修饰发生了持久的改变,从而导致其表达活性的改变。本研究拟建立高血糖代谢记忆细胞模型,观察eNOS基因的表观遗传学改变,并对其具体机制进行探讨。
　　方法:高血糖代谢记忆人主动脉内皮细胞分为4组,同:第一部分一致:1)正常对照组;2)持续高糖组;3)代谢记忆组;4)渗透压对照组。采用电转染法,向内皮细胞转染Set7特异性的ShRNA表达质粒或者过表达质粒,使内皮细胞沉默Set7基因的表达或者过表达Set7基因。采用染色质免疫共沉淀技术(CHIP)检测内皮细胞表观遗传学修饰相关指标:eNOS基因启动子区H3K4m1,H3K4m2,H3K4m3,H3K9m2及H3K4m3修饰水平以及set7在eNOS基因启动子区富集水平。
　　结果:在人主动脉内皮细胞中,前期短暂高糖导致eNOS基因表达持续增加,eNOS基因启动子区H3K4m1修饰水平持续升高以及介导H3K4m1修饰的甲基转移酶Set7含量增加,而H3K9m2及H3K9m3的修饰水平则持续下降,即使转为正常糖浓度培养仍不能逆转这一变化。沉默细胞内Set7基因的表达则可逆转高糖导致eNOS基因表达的持续增加,逆转eNOS基因启动子区Set7含量的增加及上述表观遗传修饰的改变;而使内皮细胞过表达Set7基因则得到相反的结果。
　　结论:早期高糖诱发了人主动脉内皮细胞中内皮型一氧化氮合成酶(eNOS)基因启动子区表观遗传学修饰持久的改变,从而导致eNOS基因表达活性的持久改变,即使恢复正糖后仍未逆转这一改变;而甲基转移酶Set7介导了eNOS基因启动子区表观遗传学修饰的改变。

目录

封面

声明

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引言

参考文献

第一部分：内皮型一氧化氮合成酶在高血糖“代谢记忆”形成中的作用机制研究

中文摘要

英文摘要

前言

实验方法

1 试剂

2 主要仪器与设备

3 细胞培养

4 实验动物及分组

5 Real-time PCR法检测相关基因mRNA表达水平

6 western blot 技术评估蛋白水平

7 活性氧（ROS）检测

8. NO的检测

结果

1. 细胞实验部分

2. 动物实验部分

讨论

参考文献

第二部分 高血糖代谢记忆中内皮型一氧化氮合成酶基因的表观遗传学改变

中文摘要

英文摘要

前言

材料与方法

1. 试剂

2. 主要仪器与设备

3 .细胞培养

4. 转染质粒载体的构建

5. 细胞电转染

6. HAEC细胞电转染效率检测

7. Real-time PCR及Western Blot法检测

8. 染色质免疫共沉淀（CHIP）检测

结果

1.前期短暂高糖导致HAEC细胞eNOS基因表达持续增加

2.前期短暂高糖导致HAEC细胞eNOS基因启动子区H3K4m1修饰水平持续改变

3. 前期短暂高糖导致HAEC细胞Set7持续高表达以及eNOS基因启动子区Set7含量增加

4. Set7 介导了高糖诱导的eNOS基因激活以及H3K4m1修饰水平改变

5.前期短暂高糖导致HAEC细胞eNOS基因启动子区H3K9m2及H3K9m3修饰水平的持续下降

讨论

参考文献

综述

全文总结与展望

致谢