Munc13蛋白调控萼状突触的突触传递和可塑性的作用机制研究

摘要

Munc13蛋白家族是一类在突触前活性区特异性表达的多结构域蛋白。在中央神经系统中（CNS）, Munc13蛋白家族主要包括 Munc13-1, Munc13-2(ubMunc13-2, bMunc13-2)和Munc13-3。这类蛋白的主要功能是使得含有神经递质的小囊泡可以被释放。完全缺失Munc13蛋白的突触由于突触囊泡不具有释放的能力进而丧失了突触传递的功能。这类蛋白的另外一个重要的功能是调节突触传递的可塑性，不同的Munc13蛋白可以介导不同的突触可塑性。目前研究表明，基因敲除Munc13-2和Munc13-3并不影响单个刺激下神经元中囊泡的释放，这说明在这个功能上这两种Munc13蛋白是冗余的。不过在某些神经元突触中，Munc13-2或 Munc13-3的缺失会改变在反复刺激中囊泡的释放即突触可塑性，而在另外一些神经元突触中，它们的缺失并不改变突触可塑性。为了理解为何同种Munc13蛋白会在不同神经元中存在功能上的差异，对萼状突触（calyx of Held synapse）中Munc13蛋白家族的功能进行研究。首先，我们发现在萼状突触中有三种不同的Munc13蛋白表达，分别是Munc13-1，ubMunc13-2和Munc13-3。通过对敲除Munc13基因的小鼠中萼状突触的详尽电生理分析，我们发现Munc13-2和Munc13-3并不影响萼状突触的突触传递，但是在同时敲除Munc13-2和Munc13-3基因的突触中，跟只单单敲除Munc13-2或Munc13-3，或是正常的突触相比，囊泡释放速度变快，突触延迟变短，可释放囊泡库中囊泡数量变少，快速释放囊泡数量不变，慢速释放囊泡数量减少30％，并且在可释放囊泡库耗尽后囊泡的钙依赖性恢复速率变快。通过立体定位注射带有Munc13-1N末端（1-451）的腺病毒到刚出生的Munc13-2-3DKO小鼠蜗腹侧核区的方法在萼状突触中过量表达 Munc13-1N末端后，我们发现萼状突触的突触传递被极大的削弱，这种削弱是由于囊泡库中可释放囊泡的数目减少引起的，这表明萼状突触也是 Munc13-1依赖的并且Munc13-1是主要的priming蛋白。通过对Munc13-EYFP/EGFP做定量免疫组织化学方法分析，和合作者发现Munc13-1是萼状突触中表达量最高的Munc13蛋白，并且Munc13-1蛋白更多的定位于活性区中或紧邻活性区。
　　综合以上实验结果可以得出这样的结论：
　　（1）萼状突触中有三种Munc13蛋白表达，分别是Munc13-1，ubMunc13-2和Munc13-3。
　　（2）在正常的萼状突触中，Munc13-1是起作用的主要的priming蛋白，而Munc13-2和Munc13-3蛋白在介导基本突触传递上是冗余的。
　　（3）在正常的萼状突触中，Munc13-1和Munc13-2，Munc13-3之间会竞争性的介导囊泡的priming。在同时敲除Munc13-2和Munc13-3的突触中，Munc13-1介导的囊泡释放更快，延迟更短，这估计是由于Munc13-1介导的囊泡离电压依赖性钙通道更靠近而引起的。
　　（4）Munc13蛋白可以调控囊泡库的钙依赖性恢复，不同的Munc13蛋白对囊泡的钙依赖性恢复具有不同的调控能力。
　　（5）Munc13-1是萼状突触中表达量最丰富的Munc13蛋白。不同的Munc13蛋白具有不同的细胞亚定位，跟Munc13-2，Munc13-3相比，Munc13-1蛋白更靠近突触前活性区。
　　（6）Munc13-1可能具有介导慢速释放囊泡到快速释放囊泡的转换功能。

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1 绪论

1.1 突触传递的基本性质

1.1.1 突触传递的囊泡学说

1.1.2 囊泡释放的特征

1.1.3 突触传递的可塑性

1.2 萼状突触中的突触传递研究

1.2.1 萼状突触

1.2.2 萼状突触中突触传递的性质

1.2.3 萼状突触中突触传递的短时程可塑性

2 实验技术与方法

2.1 小鼠脑切片的制备

2.2 脑切片膜片钳记录技术

2.2.1 仪器与软件

2.2.2 脑片膜片钳记录模式

3 Munc13蛋白对萼状突触的突触传递和可塑性的作用机制研究

3.1 前言

3.2 实验材料和方法

3.2.1 小鼠的培养与繁殖

3.2.2 小鼠立体定位病毒注射

3.2.3 小鼠急性脑片的制备

3.2.4 电生理实验记录

3.2.5 数据分析

3.2.6 去卷积分析

3.3 实验结果

3.3.1 Munc13-1，ubMunc13-2,Munc13-3在萼状突触中表达

3.3.2 Munc13-2KO,Munc13-3KO并不改变萼状突触的突触传递和100Hz刺激下 的突触可塑性

3.3.3 Munc13-2-3DKO并不影响萼状突触的突触传递和100Hz刺激下的突触可塑性

3.3.4 Munc13-1（1-451）片段的过量表达影响萼状突触的突触传递和 100Hz 刺激下的突触可塑性

3.3.5 Munc13-2和Munc13-3的共同缺失加快了囊泡库耗竭后的钙依赖性恢复

3.3.6 通过对突触前进行长时程去极化刺激发现Munc13-2和Munc13-3的共同缺失导致了囊泡数目减少并且囊泡库的组成发生改变

3.3.7 Munc13-1是萼状突触主要表达的Munc13蛋白并且Munc13蛋白之间具有不同的亚细胞定位

3.4 讨论

4 总结与展望

4.1 全文总结

4.2 展望

致谢

参考文献

附录1 攻读学位期间发表的论文目录

附录2 符号和缩略词表