单细胞蛋白质组学新方法研究

摘要

后基因组时代，以核酸、蛋白质、代谢物以及它们之间相互作用网络为对象的各种“组学”研究，已经成为发现生命的化学基础和加速人们对其分子机制更加深入了解的主要工具。尤其是最年来，癌症和干细胞等领域的重大突破揭示了群体细胞中某些细胞在功能上表现出的异质性，对“组学”研究向单细胞水平延伸提出了明确的需求，催生了多种单细胞分析方法产生和快速发展，例如，微流控芯片、流式细胞术、质谱、拉曼光谱等高灵敏度、高通量和高分辨率的分析手段，为单细胞基因组、单细胞蛋白质组和单细胞代谢组等单细胞组学研究提供了强大的研究手段。
　　流式细胞术和化学细胞术是单细胞蛋白质组研究的两大核心技术。基于最近发展起来的基于活性的荧光探针（ABP, Activity-Based Probe）技术，本文提出一种新的单细胞蛋白质组学（Single-cell proteomics）分析方法，将流式细胞术功能性标记理念与化学细胞术的单细胞全局蛋白质组分析理念相结合，从功能入手，建立了单细胞功能蛋白质组研究新策略。基于该策略，构建了达到单细胞检测水平的毛细管电泳-激光诱导荧光系统，并结合ABP探针的特异性和荧光报告特性，对细胞表面低丰度的膜受体蛋白家族（GABAB受体）和细胞器内的难以标记的蛋白酶（半胱氨酸组织蛋白酶）进行单细胞蛋白质组分析。主要工作内容如下：
　　（1）发展了高分辨率、高灵敏度、适用于单细胞分析的毛细管电泳-激光诱导荧光装置。构建了单细胞进样装置，能够精准地将单个目标细胞导入毛细管中，并验证了系统的可靠性；利用聚丙烯酰胺等对毛细管内壁进行了共价修饰，以防止蛋白质吸附并提高分离效率，对分子量标记蛋白质进行分离表明，其分辨率达到了文献报道的最好水平；采用荧光素样品，证实了本系统的检测限为4×10-12M；对毛细管区带电泳和毛细管筛分电泳两种电泳模式，都获得了较高的重现性。
　　（2）基于上述平台，发展了一种基于ABP的单细胞蛋白质组学新方法，并详细研究了细胞膜表面低丰度GABAB家族功能性蛋白质组表达。ABP探针在分子结构上由串联的3个功能域(ABC)构成：A域为向导区，通过识别靶蛋白质与其形成非共价结合；B域为锚定区，通过点击化学将该分子共价结合在靶蛋白质上；C域为指示区，为高灵敏的荧光分子结构。通过ABP探针，可以高选择性地实现单细胞上指定的蛋白质群的功能化标记；标记的细胞再通过单细胞毛细管电泳获得单细胞功能性蛋白质组表达谱。为验证该方法的可靠性，首先获得了单个HEK细胞的GABAB1(GB1)-like蛋白质组表达谱，通过对比过量表达GB1的HEK细胞蛋白质表达谱和蛋白质分子量谱，确认了GB1在图谱中的位置；在单细胞水平，对比了GB1在HEK、MEF和CHO等不同细胞系之间以及同一MEF细胞系内不同细胞之间的表达结果，发现不同细胞系之间或同一细胞系不同细胞之间差异明显；将上述方法应用于小鼠原代颗粒神经元细胞(CGN)的GB1表达分析，发现同源细胞群体内部的细胞异质性，进一步的GB1拮抗剂和激活剂的药物竞争性实验证实了结果的可靠性。
　　（3）对于细胞胞质、甚至细胞器内的各种酶类而言，细胞膜成为了阻碍活性探针进入细胞并标记它们的第一道屏障。针对半胱氨酸组织蛋白酶的，设计能够透过细胞膜的ABP探针，用活细胞实时荧光成像的方法确定了探针孵育、恢复时间等细胞标记的关键参数。基于该ABP探针和单细胞功能蛋白质组分析新策略，研究了单个细胞水平半胱氨酸组织蛋白酶的表达谱。并对比了群体细胞水平半胱氨酸组织蛋白酶PAGE检测及质谱鉴定结果，证实了结果的可靠性。
　　综上所述，本文发展的单细胞功能性蛋白质组学新方法既能够研究细胞膜表面的低丰度表面膜蛋白，亦能研究细胞内胞浆和细胞器内的功能性蛋白质，为单细胞蛋白质组研究开辟了一条新途径。

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1 绪论

1.1 细胞异质性与单细胞分析

1.2 微流控单细胞分析技术

1.3 流式细胞术单细胞研究

1.4 单细胞基因组学分析

1.5 单细胞代谢组学

1.6 单细胞蛋白质组

2 单细胞毛细管电泳-激光诱导荧光检测系统搭建

2.1 负压单细胞进样装置

2.2 毛细管内壁涂层处理

2.3 毛细管电泳-激光诱导荧光系统

2.4 本章小结

3 基于荧光活性探针的单细胞GABAB受体膜蛋白分析

3.1 GABAB受体的功能与结构

3.2 ABP与蛋白活性表达谱

3.3 单细胞GABAB受体分析

3.4 本章小结

4 基于荧光活性探针的单细胞半胱氨酸组织蛋白酶分析

4.1 半胱氨酸组织蛋白酶介绍

4.2 透膜荧光分子探针及其标记方式

4.3 透膜ABP标记细胞

4.4 单细胞半胱氨酸组织蛋白酶毛细管电泳分析

4.5 本章小结

5 总结与展望

5.1 主要内容和结论

5.2 研究展望

参考文献

附录Ⅰ攻读学位期间发表的论文

致谢