CRAC通道中STIM1自我抑制机制的研究

摘要

在免疫系统中，钙离子（Ca2+）的内流对免疫细胞的激活和行使功能起着至关重要的作用。这一过程主要是由钙库操纵的钙内流（store-operated Ca2+entry:SOCE）介导，并由定位在细胞膜上的CRAC（Ca2+release-activated Ca2+）通道完成的。CRAC通道是由定位在细胞膜上的Orai分子组成，并被定位在内质网（endoplasmic reticulum:ER）膜上的STIM（stormal interaction molecule）分子所激活。Orai分子组成了CRAC通道的钙离子选择孔，它有Orai1，Orai2和Orai3三个亚型，其中Orai1是最重要的，也是研究的最清楚的一个亚型。STIM分子能感受ER腔内钙离子浓度的变化，并激活Orai分子，开放CRAC通道，它有STIM1和STIM2两个亚型，其中STIM1是最重要的，也是研究最清楚的一个角色。在免疫细胞和非兴奋细胞中，由Orai1和STIM1组成的CRAC通道是钙离子内流的主要途径。
　　在静息状态下，STIM1均匀弥散的分布在内质网膜上，胞浆内的Ca2+浓度处于一个很低的水平（~100 nM）。当细胞受到刺激时，胞内产生的第二信使会打开ER上的Ca2+通道，导致此钙库的Ca2+大量外流，从而使ER内的钙离子浓度的下降， STIM1感受这一变化并寡聚成簇，迁移到细胞膜下与膜上的Orai1相互作用，从而激活CRAC通道，导致大量的钙离子内流。在免疫过程中，STIM1的激活对免疫细胞发挥功能起着至关重要的作用。
　　在静息状态下，STIM1 C末端和N末端都存在分子内自抑制机制。这种机制使STIM1维持在一个封闭构象，从而使其处于非活动状态，以维持胞内的低钙水平。由于STIM1 N末端的晶体结构被解出，其分子内自抑制的机理也已变得相对清晰，而 STIM1 C末端的自抑制机理还不太清楚。在本研究中，首先根据线虫源的STIM1(CeSTIM1)和人源的STIM1（hSTIM1）在静息状态下不同的定位行为，以及他们之间的序列差异，在hSTIM1中预测了一段具有抑制性的结构域（residues310-317），这段结构域可能决定了静息状态下的CeSTIM1和hSTIM1的不同定位行为。接下来，用实验证实了这一预测，并进一步在这段结构域中鉴定出一个芳香族氨基酸—316位置的酪氨酸（Tyr;Y）—对维持STIM1静息状态下的封闭构象起了决定性的作用。在静息细胞中，当与Orai1共表达时，STIM1-Y316A突变体能自发的寡聚成簇，并迁移到细胞膜下，去激活CRAC通道。从体外的实验结果看，Y316A突变的引入导致纯化的STIM1片段更容易形成高阶聚集。我们所有的结果显示，316这个位置的酪氨酸参与了STIM1 C末端静息状态下的分子内自抑制机制。认为这种自抑制能通道两种途径来达到：一，通过氢键和/疏水键与CAD结构域相互作用，从而把STIM1锁在一个失活状态；二，STIM1与STIM1之间通过以Y316为核心位点的结构域形成相互排斥力，使 STIM1处于本底的二聚状态，从而使STIM1处于失活状态。

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第一章 绪论

1.1 钙离子的研究进展

1.2 钙离子的生理功能

1.3 胞内钙稳态的实现

1.4 钙库操纵的钙流入（SOCE:store-operated Ca2+channel）

1.5 钙释放激活的钙（CRAC:Ca2+release-activated Ca2+）通道

第二章 实验技术和原理

2.1 激光扫描共聚焦显微成像技术

2.2 荧光蛋白技术

2.3 膜片钳技术

2.4 单细胞荧光测钙技术

2.5 本研究中CRAC电流的记录

2.6 CRAC电流的统计

2.7 溶液和试剂

2.8 细胞培养

2.9 免疫沉淀和Western Blot

2.10 蛋白的表达纯化和寡聚分析

第三章 静息状态下STIM1的自我抑制机理的研究

3.1 实验结果

3.2 讨论

3.3 总结与展望

致谢

参考文献

附录1 攻读学位期间发表论文目录

附录2 主要符号和缩略词