Wnt5a激活CDK5参与神经发育过程中神经元细胞周期退出

摘要

目的：
　　在神经发育过程中，细胞周期依赖性蛋白激酶（cyclin-dependent kinases,CDKs）的调控参与神经元细胞周期调控，并激活特定的分化程序。大量证据表明，CDK5活性的上调是神经发育过程中的核心事件，但其调控机制尚不清楚。Wnt信号通路在细胞发育过程中具有重要的调控作用，但在神经发育过程中，Wnt信号通路途径是否参与CDK5活性的激活，进而调控神经元细胞周期的退出，尚无研究报道。本研究中探究了在神经发育过程中经典或非经典的Wnt信号通路在CDKs及神经元细胞周期的调控中的作用机制。
　　方法：
　　（1）获取大鼠不同胚胎发育时期（E12.5，E14.5，E16.5，E18.5，P0）的大脑皮层组织；
　　（2）应用维甲酸/脑源性神经因子（RA/BDNF）联合诱导构建神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞分化模型；
　　（3）实时定量RT-PCR(qRT-PCR)方法检测大鼠不同胚胎发育时期大脑皮质组织及RA/BDNF联合诱导分化前后SH-SY5Y细胞中经典Wnt途径（wnt-1， wnt-3a）和非经典Wnt途径（wnt-4，wnt-5a，wnt-11）的mRNA表达量；并同时检测上述样品中重要与细胞周期相关的CDKs（CDK2，CDK4，CDK6）及其对性的细胞周期素（Cyclin D，Cyclin E）以及CDK5和其伴侣分子p35的mRNA表达量；
　　（4）Western Blot法检测大鼠不同胚胎发育时期大脑皮质组织及RA/BDNF联合诱导分化前后SH-SY5Y细胞中CDK5及p35的蛋白表达情况；
　　（5）体外激酶反应（in vitro Kinase assay）检测大鼠不同胚胎发育时期大脑皮质组织及RA/BDNF联合诱导分化前后SH-SY5Y细胞中CDK5的激酶活性；
　　（6）酶联免疫吸附试验（ELISA）定量检测RA/BDNF联合诱导分化前后SH-SY5Y细胞培养上清中Wnts的分泌情况；
　　（7）应用wnt蛋白（wnt-3a，wnt-4，wnt-5a，wnt-11）刺激原代培养的大鼠皮层神经元，应用体外激酶反应检测对CDK5的激酶活性的影响；应用qRT-PCR及Western Blot分别检测wnt-5a刺激原代培养的大鼠皮层神经元中CDK5和p35的mRNA及蛋白表达情况，并应用体外激酶反应检测CDK5激酶活性；
　　（8）在RA/BDNF联合诱导SH-SY5Y细胞分化模型，应用细胞免疫荧光分别标记MAP2（标记成熟神经元）及BrdU（标记分裂期细胞），检测应用wnt-5a中和抗体及wnt-5a抑制剂Box5对RA/BDNF诱导SH-SY5Y细胞分化作用的影响。
　　结果：
　　（1）在大鼠胚胎发育的大脑皮质组织中，经典途径的wnt（wnt-1，wnt-3a）则减少，而非经典途径的wnt信号（wnt-4，wnt-5a，wnt-11）的表达量增高，；RA/BDNF联合诱导分化后SH-SY5Y细胞中经典途径的wnt（wnt-1，wnt-3a）表达量降低，而非经典途径的wnt信号（wnt-4，wnt-5a，wnt-11）的表达量和分泌量增高；
　　（2）在大鼠胚胎发育的大脑皮质组织及RA/BDNF联合诱导分化的SH-SY5Y细胞中，CDKs的表达量无明显变化，但CyclinD的表达下降，而p35的mRNA和蛋白表达明显上升，CDK5激酶活性显著上调；
　　（3）Wnt-5a刺激可显著上调神经元中p35的mRNA和蛋白表达量，并激活CDK5激酶活性，而wnt-3a，wnt-4及wnt-11均无作用；
　　（4）阻断wnt-5a通路可显著抑制RA/BDNF联合诱导的SH-SY5Y细胞中CDK5的激酶活性，并抑制SH-SY5Y细胞向成熟神经元分化。
　　结论：
　　本研究证明了经典和非经典的wnt途径在神经元发育过程中具有不同的作用，非经典的wnt通路在神经元发育过程中被选择性激活，其中wnt-5a可上调p35的表达并激活CDK5，在神经发育过程中神经元细胞向成熟分化，退出细胞周期的机制中具有重要的意义。

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