新型抗生素合成酶和嗜盐纤维素酶的结构生物学研究

摘要

链霉菌通过次生代谢产生一些重要的抗生素如黑莫他丁、灰绿霉素、井冈霉素、青霉素和红霉素等。黑莫他丁作为一种新型环酯肽抗生素，具有良好的抗菌、抗肿瘤活性。而灰绿霉素是一种大环内酯类抗生素，对多种致病性细菌和真菌具有体外抑制作用。为揭示黑莫他丁和灰绿霉素合成酶的催化机理，本研究对黑莫他丁合成酶系（HmtT、HmtN和HmtS）和灰绿霉素合成酶SgvP进行了结晶工作。在收集X-ray衍射数据后，通过分子置换法解析了HmtT、HmtN、HmtS和SgvP的蛋白质晶体结构。通过与同源蛋白P450BioI的结构进行比较，推测了环酯肽底物与HmtT和HmtN可能的结合方式。为了容纳环酯肽底物进入黑莫他丁合成酶的结构域，B-C loop移向一边以留出足够的空间方便底物进入。HmtT中非常长的F-G loop具有不寻常的构造并深深地伸进活性中心，导致F/G helix的弯曲。然而，HmtN的F/G helix是直的，且HmtT和HmtN的F/G helix走向不同，这可能直接影响了这两个酶的底物特异性。通过分子对接实验，结合黑莫他丁合成酶的催化活性，推测了黑莫他丁合成酶可能的催化机制。通过结构比较，推测了SgvP上helix B、helix C和B-C loop的空间位置及helix I上Pro237残基对底物结合的影响。研究黑莫他丁合成酶和灰绿霉素合成酶的结构特征将有助于揭示这些合成酶的底物识别方式及催化机制，为挖掘酶的新功能及指导酶的功能改造提供结构基础。
　　来自Bacillus sp.G-CS10的耐碱嗜盐纤维素酶CelB包括三个结构域，呈L形排布，分别是纤维素酶超家族结构域、DUF291结构域和C-末端的未知结构域。CelB的纤维素酶结构域具有糖苷水解酶家族5的结构特征，(β/α)8 TIM-桶形成纤维素酶结构域。C-端未知结构域可能也与纤维素酶底物结合有关，与DUF291结构域协同参与纤维素酶底物的结合。本研究得到了CelB和硒代CelB的晶体并解析了结构，研究嗜盐纤维素酶CelB的结构特征将有助于揭示结构域DUF291和CelB中C-末端未知结构域在催化反应中所起的作用，阐明CelB合成酶的超常生物学稳定性及其在高盐条件下催化反应的分子机制，为指导酶的理性设计和改造、开发新功能酶提供结构基础。

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主要缩写词

第一章 绪 论

1.1 细胞色素P450基本生物化学特征

1.2 细胞色素P450催化的主要生化反应

1.3 细胞色素P450蛋白的结构

1.4 细胞色素P450与底物相互作用的研究

1.5 细胞色素P450的蛋白质工程

1.6 纤维素酶概述

1.7 蛋白质结构研究进展

1.8 研究背景及意义

1.9 技术路线

第二章 黑莫他丁合成酶的结构生物学研究

第一节 黑莫他丁合成酶的表达、纯化及性质研究

1.1 材料与方法

1.2 结果与讨论

1.3 小结

第二节 黑莫他丁合成酶的晶体生长及结构解析

2.1 材料与方法

2.2 结果与讨论

2.3 小结

第三节 黑莫他丁合成酶的晶体结构分析

3.1 材料与方法

3.2 结果与讨论

3.3 小结

第三章 灰绿霉素合成酶的结构生物学研究

第一节 灰绿霉素合成酶的表达、纯化及性质研究

1.1 材料与方法

1.2 结果与讨论

1.3 小结

第二节 灰绿霉素合成酶的晶体生长及结构解析

2.1 材料与方法

2.2 结果与讨论

2.3 小结

第三节 灰绿霉素合成酶的晶体结构分析

3.1 材料与方法

3.2 结果与讨论

3.3 小结

第四章 耐碱嗜盐纤维素酶的结构生物学研究

第一节 嗜盐纤维素酶的表达和纯化

1.1 材料与方法

1.2 结果与讨论

1.3 小结

第二节 嗜盐纤维素酶的晶体生长及结构解析

2.1 材料与方法

2.2 结果与讨论

2.3 小结

第三节 嗜盐纤维素酶的晶体结构分析

3.1 材料与方法

3.2 结果与讨论

3.3 小结

总结与展望

1.1 全文总结

1.2 研究展望

致谢

参考文献

附录1 攻读博士研究生期间发表的学术论文目录

附录2 基因序列

附录3 蛋白质二级结构预测图

附录4 晶体数据收集和结构修正表

附录5 各种仪器和设备