缬草萜内酯对体外诱导肝星状细胞增殖及氧化应激反应的影响

摘要

目的:通过FeNTA体外诱导肝星状细胞增殖的方法，观察缬草萜内酯A、B、C三种成分对肝星状细胞增殖及氧化应激反应的影响，从而探讨该物质在体外是否具有抗肝纤维化作用。
　　方法:1.增殖抑制实验：采用体外实验方法，将含3％小牛血清的DMEM传代培养的HSC悬液接种于96孔板，1×104-100μl/孔，培养至近单层贴壁后吸出旧培养液（移液器不可接触孔底），分别加入含3%小牛血清的DMEM培养液（正常对照组）、含3%小牛血清的DMEM培养液+0.1mmol/L FeNTA(模型组)、含3%小牛血清的DMEM培养液+0.1mmol/L FeNTA+秋水仙碱0.5ug/ml（阳性对照组）、含3%小牛血清的DMEM培养液+0.1mmol/L FeNTA+缬草萜内酯A、B、C（50μg-100μg-200μg-300μg-400μg/ml）各五个浓度组（实验组），每孔加药量为10μl，每组设置3个复孔，继续培养36h，弃上清后每孔均加入5mg/ml的MTT溶液20ul，37℃，继续孵育5小时，吸弃孔内MTT液，每孔加入150μl DMSO，在微量振荡器上振荡10分钟，使结晶物充分溶解。选择570nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值（OD值），每孔重复测3次，记录中位值，计算抑制率。
　　2.抗氧化实验：将含3%小牛血清的DMEM传代培养的HSC悬液接种于24孔板，5×105-500μl/孔，培养至近单层贴壁后吸出旧培养液，分别加入含3%小牛血清的DMEM培养液（正常对照组）、含3%小牛血清的DMEM培养液+0.1mmol/L FeNTA(模型组)、含3%小牛血清的DMEM培养液+0.1mmol/LFeNTA+VitE50μmol/L（阳性对照组）、含3%小牛血清的DMEM培养液+0.1mmol/L FeNTA+缬草萜内酯A、B、C（50μg-200μg-400μg/ml）各三个浓度组（实验组），每孔加药量为20μl，每组平2孔，继续培养36h后取上清液，根据试剂盒上实验方法用紫外光分光光度计法测定各组SOD、MDA的吸光度，再依据公式计算SOD活力及MDA含量。
　　结果:1.抑制增殖实验：缬草萜内酯A(400μg/ml、300μg/ml、200μg/ml)， B(400μg/ml、300μg/ml、200μg/ml、100μg/ml)，C(400μg/ml、300μg/ml、200μg/ml、100μg/ml、50μg/ml)组与模型组差异有显著性（P＜0.01），其他剂量组与模型组差异无统计学意义(P＞0.05）；缬草萜内酯A400μg/ml组、B（400μg/ml、300μg/ml）、C(400μg/ml、300μg/ml、200μg/ml)与阳性对照组比较差异有显著性（P＜0.01），A300μg/ml组及B200μg/ml组与阳性对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05），余各组与阳性对照组差异无统计学意义（P＞0.05）；模型组与空白对照组比较差异具有显著性（P＜0.01）。
　　2.抗氧化实验：
　　2.1.SOD活力：缬草萜内酯A、B、C各组的SOD活力均高于模型组，其中A400μg/ml组、B（400μg/ml、200μg/ml）、C（400μg/ml、200μg/ml）与模型组差异具有显著性（P＜0.01），A200μg/ml组、C50μg/ml组与模型组差异有统计学意义（P＜0.05），而A50μg/ml组、B50μg/ml组与模型组差异无统计学意义（P＞0.05），表明除A50μg/ml组、B50μg/ml组外的各组均有一定的抗氧化作用；缬草萜内酯C400μg/ml组的SOD活力高于阳性对照组，二者之间的差异有统计学显著性（P＜0.01），余各组均低于阳性对照组，差异均有显著性（P＜0.01），表明C400μg/ml组抗氧化作用强于维生素E组，而其余各组作用均不及维生素E组。
　　2.2.MDA含量：缬草萜内酯A、B、C各组的MDA含量均小于模型组，其中A50μg/ml组、B50μg/ml组与模型组差异无统计学意义（P＞0.05），C50μg/ml组与模型组差异有统计学意义（P＜0.05），余各组与模型组差异有显著性（P＜0.01），表明除A50μg/ml组、B50μg/ml组外的各组均有一定的抗氧化作用；缬草萜内酯B400μg/ml组及C400μg/ml组的MDA含量低于阳性对照组，其中B400μg/ml组与阳性对照组差异无统计学意义（P＞0.05），C400μg/ml组与阳性对照组差异有显著性（P＜0.01），余各组MDA含量均高于阳性对照组，A400μg/ml组与阳性对照组差异无统计学意义（P＞0.05），余各组与阳性对照组差异有统计学意义（P＜0.05），表明C400μg/ml组抗氧化作用强于维生素E50μmol/L浓度组，A400μg/ml组、B400μg/ml组抗氧化作用可能与维生素E组相当，而其余各组作用均不及维生素E组。
　　结论:1.缬草萜内酯A、B、C不同浓度对次氮基三醋酸铁诱导的HSC增殖均有不同程度的抑制作用，且存在一定剂量依赖趋势，即随着药物作用浓度增加，抑制作用越强。从三种成分的抑制率来看，C的抑制效果最强，B次之，A作用最弱。
　　2.缬草萜内酯A、B、C在不同浓度(A50μg/ml、B50μg/ml组除外)均有一定抗氧化应激的作用。当给予不同浓度A、B、C后，MDA的水平降低，而SOD水平升高，且存在一定剂量依赖趋势，随着药物浓度的增加，SOD活力逐渐升高，MDA含量逐渐下降。
　　3.缬草萜内酯A、B、C相同浓度比较，C成分的抗氧化作用明显强于A、B，而B成分作用稍强于A，但在50μg/ml组时A、B、C三种成分抗氧化作用无明显差异。
　　4.缬草萜内酯C400μg/ml组的SOD活力高于阳性对照组，MDA含量低于阳性对照组，且差异显著，说明C400μg/ml组抗氧化作用强于维生素E50μmol/L浓度组。

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