人胚胎干细胞体外分化为脊髓运动神经元祖细胞过程中MicroRNA及基因表达谱的研究

摘要

目的：
　　通过研究人胚胎干细胞体外定向分化为脊髓运动神经元祖细胞过程中microRNA及mRNA的表达谱情况，筛选差异表达microRNA及mRNA，并对感兴趣microRNA及其靶mRNA进行real-time PCR验证，从而试图发现一些调控人胚胎干细胞向脊髓运动神经元祖细胞分化过程中的关键microRNA及mRNA，为运动神经元损伤及再生提供新的治疗靶点。
　　方法：
　　使用小分子化合物SB4315422μM、LDN1931890.3μM、CHIR990212mM及化学成分限定培养体系于体外在饲养层细胞的支持作用下先将人胚胎干细胞定向诱导分化为神经上皮细胞。上述三种小分子化合物（浓度不变）再结合另外两种小分子化合物RA0.1μM，Purmorphamine0.5μM在新鲜饲养层细胞的支持下将神经上皮细胞诱导分化为脊髓运动神经元祖细胞，然后撤去SB431542、LDN193189、CHIR99021，保留RA、Purmorphamine(浓度不变)悬浮培养一周提高纯度，收集hESC及神经上皮、脊髓运动神经元祖细胞这三个关键时期标本，进行RNA抽提，对RNA进行质量检测后分别进行microRNA和mRNA表达谱检测；使用miRanda、miRbase、targetScan数据库对所检microRNA进行靶基因预测；将预测所得靶基因和所检mRNA芯片联合分析；对mRNA芯片进行生物信息学分析，信号通路分析，构建microRNA调控网络图。挑选不同分化阶段差异表达microRNA及相应靶基因，进行real-time PCR验证。
　　结果：
　　（1）人胚胎干细胞向神经上皮细胞分化过程中microRNA表达谱及基因表达谱发生明显改变。347个microRNA下调大于2倍，134个microRNA上调大于2倍。对应的基因芯片中，2252个基因上调表达大于2倍；2404个基因下调表达大于2倍。Hsa-miR-141-3p下调解除了对ZEB2的抑制，hsa-miR-365b-3p下调解除了对PAX6的抑制参与人胚胎干细胞分化为神经上皮细胞。
　　（2）神经上皮细胞向脊髓运动神经元祖细胞分化过程中microRNA及基因表达谱发生明显改变：189个microRNA表达下调大于2倍；298个microRNA上调大于2倍。对应的基因芯片中，6098个基因上调表达大于2倍；5963个基因下调表达大于2倍。hsa-miR-93上调抑制了PTEN基因的表达，从而参与神经上皮细胞向脊髓运动神经元的分化。Hsa-miR-9-3p、hsa-miR-30e-3p表达下调，其分别对应的靶基因HOXB4、NKX6-1 real-time PCR证实表达均上调，提示上述microRNA表达下调解除了对其靶基因的抑制从而参与神经上皮细胞向脊髓运动神经元祖细胞的分化。
　　结论：
　　（1）Hsa-miR-342-5p,hsa-miR-345-3p,ZEB2等大量的microRNA及基因参与了人脊髓运动神经元祖细胞的发育。
　　（2）Hsa-miR-141-3p下调解除了对ZEB2基因的抑制，hsa-miR-365b-3p表达下调解除了对PAX6基因的抑制从而使其表达增加，参与人胚胎干细胞向神经上皮细胞的分化。
　　（3）Hsa-miR-93上调抑制了PTEN基因的表达，从而参与神经上皮细胞向脊髓运动神经元的分化。Hsa-miR-9-3p、hsa-miR-30e-3p表达下调，可能解除了对靶基因HOXB4、NKX6-1的抑制而参与神经上皮细胞向脊髓运动神经元祖细胞的分化。

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中英文对照表

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1前言

2 材料与方法

3结果

4 讨 论

5 结论

6 展望与不足

参考文献

综述

参考文献

致谢