IL-33促进Th2应答和抑制Th17应答的效应能够缓解小鼠缺血性脑损伤

摘要

白细胞介素（Interleukin，IL）-33是近年来发现的IL-1家族新成员，它作为细胞因子，可通过IL-33/ST2信号通路促进Th2型免疫反应，同时也是一种核蛋白，可参与调控基因转录。在炎性刺激下，IL-33还可以作为一种“警报素”警示组织损伤或应激。IL-33是ST2受体的唯一特异性配体，其生物学活性的发挥主要依赖与跨膜型ST2受体（ST2L）结合。IL-33调节免疫反应的作用具有多样性，取决于不同的疾病和模型。IL-33可促进Th2型炎症性疾病的发病，如哮喘、特应性皮炎和过敏反应等，然而在一些与Th2型免疫反应相关的疾病或模型，如动脉粥样硬化、多发性硬化和实验性肠炎等，IL-33可通过促进Th1/Th2平衡向Th2偏移而起到保护性作用。此外，新近研究还发现了IL-33可调节Th17型免疫应答。IL-33在多组织器官高表达，而脑和脊髓是IL-33表达量最高的器官之一，提示IL-33在调节中枢神经系统的病理生理学过程中可能起着重要作用。近年来，有关IL-33或IL-33/ST2信号通路在中枢神经系统疾病中的作用是神经免疫学的研究热点之一。
　　缺血性脑卒中是中老年人常见的脑血管疾病，可以导致脑组织损伤并伴随炎症反应，从而引发一系列症候群。研究表明，Th1/Th2介导的免疫应答以及Th17型免疫应答在缺血性脑损伤的炎性病理机制中发挥重要作用。IL-33作为Th2型免疫反应的关键活化分子，在缺血性脑卒中发病机制中的作用仍有待阐明。为了探讨IL-33在缺血性脑卒中发病过程中的作用及其机制，本研究利用缺血性脑卒中动物模型，观察缺血性脑损伤时IL-33及其受体ST2L表达的变化规律，并探讨IL-33对缺血性脑损伤程度的影响。论文共分为三个部分，主要内容和结果如下：
　　一、短暂性脑缺血后IL-33及其受体ST2L的表达
　　目的：检测IL-33及其受体ST2L在短暂性脑缺血后不同时程和不同脑区的表达情况，探讨缺血性脑损伤时IL-33及其受体ST2L表达的规律性。
　　方法：利用线栓法闭塞大脑中动脉（MCAO）30min诱导建立小鼠可逆性局灶性脑缺血再灌注损伤模型，通过半定量RT-PCR和Western blot检测缺血再灌注后超急性期（6h）、急性期（24h）和延迟期（3d）缺血侧脑组织IL-33 mRNA和蛋白表达水平，并通过免疫组织化学染色观察了IL-33在不同缺血脑区（运动皮层、感觉皮层、海马和纹状体）各时间点的表达情况。此外，对IL-33的受体ST2L mRNA表达水平也进行了检测。
　　结果：与假手术组相比，IL-33 mRNA和蛋白水平在MCAO6 h和3d表达减少，ST2L mRNA表达水平在MCAO24 h和3 d表达减少，其它时间点IL-33和ST2L表达无显著改变。除了MCAO24 h组运动皮层和纹状体阳性染色增加外，IL-33阳性细胞数在缺血后不同时程各脑区均有不同程度减少。
　　结论：MCAO模型小鼠缺血再灌注后IL-33和ST2L表达的总体趋势是下降的，提示短暂性脑缺血后IL-33/ST2L介导的Th2型免疫应答是下调的。
　　二、侧脑室注射IL-33对MCAO模型脑损伤的影响
　　目的：观察外源性IL-33作用于MCAO模型后，对缺血性脑损伤严重程度、脑组织炎症及脾脏免疫功能的影响。
　　方法：利用GST表达纯化系统构建小鼠IL-33成熟肽的重组质粒，并纯化制备具有生物学活性的IL-33蛋白。在小鼠MCAO模型前30min侧脑室注射IL-33（2μg，5μl）或PBS5μl，于缺血再灌注后不同时间点（6h，24h和3d）通过Zea Longa评分法评估神经行为学症状，TTC染色法评估脑梗死体积，H&E染色观察缺血侧海马及皮层炎性细胞浸润情况，并观察脾脏大小的改变。
　　结果：与侧脑室注射PBS的MCAO对照组相比，侧脑室注射IL-33可减轻MCAO24 h和MCAO3 d的神经行为学症状（24h：2.0±0.302 vs2.875±0.125；3d：1.833±0.167vs2.917±0.193；p＜0.05）和脑梗死体积（24h：21.89±4.8％ vs36.27±1.6％；3 d：8.52±4.17％vs37.08±3.35％；p＜0.05）。组织学染色显示侧脑室注射IL-33的MCAO24 h和MCAO3 d缺血侧海马和皮层炎性细胞浸润数量较少。此外，侧脑室注射IL-33也增加了MCAO24 h和MCAO3 d的脾脏指数（24h：0.36±0.02 vs0.31±0.04；3 d：0.30±0.05 vs0.22±0.01；p＜0.05），脾脏萎缩不明显。与对照组相比，侧脑室注射IL-33对MCAO6 h组的神经行为学症状、脑梗死体积、脑组织炎性浸润、脾脏指数及大小均无明显差异。
　　结论：侧脑室注射IL-33可减缓短暂性脑缺血再灌注后急性期和延迟期的脑损伤及炎症程度，并缓解了脾脏免疫功能的抑制。
　　三、IL-33减缓短暂性脑缺血后脑损伤的免疫学机制
　　目的：探讨侧脑室注射IL-33缓解MCAO模型缺血再灌注后急性期和延迟期脑损伤及炎症程度的免疫学机制。
　　方法：分离侧脑室注射IL-33的MCAO24 h和MCAO3 d组缺血脑和脾脏中的单个核细胞，通过流式细胞术检测Th1、Th2和Th17细胞亚群的改变，以及用ELISA检测血清中细胞因子IFN-γ、IL-4和IL-17的表达。
　　结果：与侧脑室注射PBS的MCAO对照组相比，侧脑室注射IL-33可减少MCAO24 h和MCAO3 d脑组织中IL-17+T细胞和IFN-γ+T细胞的百分比，并增加了IL-4+T细胞的阳性率，Th1/Th2比值下降。与此同时，侧脑室注射IL-33也减少了脾脏中IL-17+T细胞和IFN-γ+T细胞的百分率，但对IL-4+T细胞的阳性率无明显影响。相应地，侧脑室注射IL-33也减少了血清中IL-17和IFN-γ的表达量，增加了IL-4的表达量。
　　结论：IL-33减缓短暂性脑缺血后急性期和延迟期损伤严重程度的作用可能与促进Th2型免疫反应和抑制Th17型免疫反应有关。
　　本研究首次在小鼠MCAO模型的基础上检测了IL-33及其受体ST2L在缺血再灌注后超急性期到延迟期的表达情况，发现IL-33和ST2L在短暂性脑缺血后的总体表达趋势是下降的，通过侧脑室注射IL-33可显著改善MCAO模型小鼠缺血再灌注后急性期和延迟期的损伤严重程度，其可能机制是外源性IL-33促进Th1/Th2平衡向Th2偏移和抑制Th17型免疫应答有关。本研究为改善脑卒中预后和治疗提供了新思路。

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前言

第一部分 短暂性脑缺血后IL-33及其受体ST2L的表达

材料和方法

结果

讨论

第二部分 侧脑室注射IL-33对MCAO模型脑损伤的影响

材料和方法

结果

讨论

第三部分 IL-33减缓短暂性脑缺血后脑损伤的免疫学机制

材料和方法

结果

讨论

小结

参考文献

综述

附录

附录1：英文缩略词表

附录2：pGEX-6P-1质粒图谱

附录3：攻读学位期间发表的学术论文

致谢