特异性抑制5型磷酸二酯酶通过缓解内质网应激治疗心力衰竭的作用及其机制

摘要

研究背景与目的：
　　磷酸二酯酶基因家族（PDE family）在体内广泛分布，有11种亚型。PDE家族的主要功能是水解细胞内的第二信使3'，5'-环状腺苷酸（cAMP）和（或）3'，5'-环状鸟苷酸（cGMP），继而影响其下游蛋白激酶活性，从而调控各种生物学效应。目前，作用于PDE的药物如磷酸二酯酶抑制药已在临床上广泛应用，如治疗心血管疾病、肺动脉高压、勃起功能障碍和哮喘等。
　　在全球范围内，心力衰竭（Heart Failure，HF）是威胁人类健康和增加医疗负担最主要的疾病之一。有研究发现，内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ER stress）在心力衰竭病人的心肌中被激活，并被证明是心力衰竭发生和发展的重要机制。不仅如此，有研究发现特异性水解cGMP的5型磷酸二酯酶（PDE5）在心力衰竭的病人心肌中表达明显升高。5型磷酸二酯酶的抑制剂具有明显的抗心肌肥厚和心力衰竭的作用。而在心肌肥厚及心力衰竭中，5型磷酸二酯酶与内质网应激的关系目前尚无报道。本研究通过使用人的心力衰竭的组织标本、心力衰竭的动物模型以及相关的细胞实验研究5型磷酸二酯酶与内质网应激的关系。
　　实验方法与结果：
　　首先，在人的心力衰竭的组织标本中寻找5型磷酸二酯酶与内质网应激的关系。本实验用到了4例因扩张型心肌病行心脏移植术的心脏标本、6例因心力衰竭行二尖瓣置换术的心脏标本，以及4例因交通事故死亡的正常心脏标本。应用Western blotting的方法检测这些组织标本中内质网应激的激活状态和PDE5的表达。结果显示，内质网应激的效应分子，包括P-PERK、GRP78、XBP1s和CHOP，在心力衰竭的组织样品中表达都显著升高。有趣的是，还发现PDE5在衰竭的心脏组织中的表达也明显升高，并且PDE5高表达的程度与内质网应激标志物表达增加的程度明显相关。由此说明，在心力衰竭中PDE5的表达与内质网应激可能存在相关关系。
　　随后，用异丙肾上腺素（isoproterenol，Iso）和胸主动脉缩窄术（transverse aortic constriction，TAC）建立了两种心力衰竭的动物模型。通过形态学、血流动力学和心脏超声检测，发现PDE5抑制剂能够明显缓解Iso和TAC诱发的心肌肥厚和心力衰竭。为进一步研究抑制PDE5是否能够缓解心力衰竭中的内质网应激，本实验检测了动物模型中内质网应激的标志物。结果发现，PDE5抑制剂（西地那非）明显地缓解心力衰竭中内质网应激标记物的高表达。严重或长期的内质网应激触发细胞凋亡，这被认为是内质网应激导致心力衰竭的关键机制。为此，本实验检测了内质网应激特异的凋亡蛋白C/EBP同源蛋白（C/EBP homologous protein，CHOP）的表达和心力衰竭中凋亡细胞的数量。研究结果表明，在心力衰竭动物模型中，PDE5抑制剂能够明显抑制CHOP的表达和心肌细胞的凋亡。为进一步明确抑制PDE5对内质网应激的作用，用Iso、毒胡萝卜素（thapsigargin，TG。TG是一种内质网膜钙泵抑制剂。它可以促进内质网腔内钙清空导致内质网应激，是特异性的内质网应激刺激剂。）和西地那非干预H9c2（2-1）心肌细胞。结果显示，在体外实验中抑制PDE5同样可以缓解内质网应激以及其介导的心肌细胞凋亡。
　　此外，还研究了蛋白激酶G（PKG）在PDE5抑制剂抗内质网应激中的作用。结果显示，PKG的抑制剂KT5823和DT3部分扭转了PDE5抑制剂西地那非在心肌细胞中的抗内质网应激作用。这提示PKG途径部分参与了PDE5抑制剂对内质网应激的保护作用。肌浆网钙调节蛋白和细胞内钙稳态与内质网应激密切相关。因此，我们在心力衰竭动物模型中检测了肌浆网钙调节蛋白肌浆网（内质网）钙泵2a（sarco/endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase2a，SERCA2a）和受磷蛋白（phospholamban，PLB）的表达。结果显示，抑制PDE5扭转了心力衰竭动物模型心肌中SERCA2a和磷酸化的PLB（P-PLB）的表达下调。这提示，PDE5抑制剂可能是通过对SERCA2a和P-PLB表达的调控从而发挥其抗内质网应激的作用。为进一步明确其具体作用机制，本研究运用PLB的野生型质粒和突变型质粒（16位丝氨酸→丙氨酸）确定PLB16位丝氨酸在PDE5抑制剂抗内质网应激效应中起关键作用。
　　结论：
　　综上所述，在心力衰竭的动物模型中特异性抑制PDE5可以明显改善心脏功能，并且能够明显缓解心力衰竭中的内质网应激。抑制PDE5治疗心力衰竭的机制可能是通过其抗内质网应激的作用实现的。这为PDE5抑制剂用于心力衰竭的治疗提供了新的理论依据，也为心力衰竭的治疗提供了新的思路。

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研究背景

第一部分特异性抑制5型磷酸二酯酶缓解心力衰竭中内质网应激

1. 实验设备、材料、试剂与方法

2. 实验结果

3. 本部分小结与讨论

第二部分特异性抑制5型磷酸二酯酶缓解心力衰竭中内质网应激的机制研究

1. 实验设备、材料、试剂与方法

2．实验结果

3. 本部分小结与讨论

全文讨论

参考文献

综述

参考文献

主要试剂的配制

英文缩写及中英文对照

附录

致谢